Спосіб збереження культури бактерій cytophaga hutchinsonii кмоу-89 з наявністю фітостимулюючої активності

Спосіб збереження культури бактерій Cytophaga hutcinsonii KMOУ-89 з наявністю фітостимулюючої активності, який полягає в тому, що попередньо штами бактерій вирощують на сере 3 18431 Відомий спосіб має недоліки, тому що не гарантує популяційних змін, що у свою чергу приводять до морфологічних, антигених, фізіологічних та генетичних змін, оскільки, при ліофілізації бактеріальні культури піддаються впливу декількох стресових факторів : заморожуванню, висушуванню з наступною регідратацією, що приводить до зниження титру життєздатних клітин штаму бактерій роду Cytophaga у процесі збереження. Крім того, не всі культури бактерій у силу своїх біологічних властивостей, можуть зберігатися зазначеним способом. В основу корисної моделі поставлена задача підвищити збереження як життєздатності клітин бактерій Cytophaga hutcinsonii, причому у фізіологично активному стані, так і збереження характерної та корисної властивості штаму Cytophaga hutcinsonii, а саме - фітостимулюючої активності. Це досягається шляхом того, що культуру бактерій Cytophaga hutcinsonii попередньо вирощують на середовищі Гетчинсона та Клейтона з джерелом целюлози, після чого, готують бактеріальні суспензії із змістом кліток n 109кл/мл,які потім поміщають у стерильні ємності та зберігають тривалий час при кімнатній температурі. Відмінною рисою пропонованого способу збереження є те, що суспензію культури бактерій Cytophaga hutcinsonii перед тим, як помістити в стерильні ємності, наносять на стерильний твердорфазний носій - активоване вугілля, після чого висушують при температурі 28-30°С, а вже потім поміщають у стерильні флакони, що герметезируют; а далі зберігають тривалий час. У результаті застосування такого способу зберігається не тільки життєздатність бактеріальної культури в більш високому титрі клітин, але і зберігається здатність штаму Cytophaga hutcinsonii стимулювати ростові процеси сільськогосподарських рослин, що підтверджується наступними прикладами: Приклад №1. У лабораторних умовах кафедри мікробіології Одеського національного університету ім.Мечникова проведені порівняльні іспити двох методів збереження культури бактерій Cytophaga hutcinsonii: 1) відомий традиційний метод ліофілізації (прототип); 4 2) пропонований для патентування спосіб іммобілізації культури бактерій Cytophaga hutcinsonii на твердофазном носії органічної природи активованому вугіллі. Загальними ознаками обох способів збереження є наступні: Штам бактерій Cytophaga hutcinsonii після попереднього вирощування на середовищі Гетчинсона і Клейтона з джерелом целюлози, змивали фізіологічним розчином, готували бактеріальну суспензію зі змістом кліток n 109кл/мл та поміщали у стерильні ємності для збереження. Відмітними ознаками пропонованого способу були наступні. Після готування бактеріальної суспензії культуру Cytophaga hutcinsonii наносили на дисперсний стерильний носій активоване вугілля марки БАУ-Б (ДСТ 6217) з розміром часток від 1,0 до 3,6мм і після "м'якого" висушування протягом 36-38 годин у термостаті при температурі 28-30°С, клітини бактерій разом з носієм поміщали в стерильні флакони для збереження тривалий час. Збереження штаму за критеріями життєздатності та фітостимулюючої активності культур відомим (прототип) і пропонованим способом (іммобілізація на твердорфазному дисперсному носії) контролювалася через добу, місяць, 6 місяців, рік. Для цього розкривали флакони та ампули і для регидратації клітин, додавали фізіологічний розчин, кількість життєздатних клітин визначали послідовним титруванням 10-кратних розведень із трьох ампул (по способу прототипу) і трьох флаконів (по пропонованому способу), висівали на середовище Гетчинсона і Клейтона з джерелом целюлози в 5-кратній повторності. Чисельність клітин, що вижили, перераховували як середнє арифметичне всіх повторностей у 1мл для способу прототипу, а для пропонованого способу чисельність розраховували на 1г твердофазного носія активованого вугілля. Збереження фітостимулюючої активності контролювалася при інокуляції досліджуваними штамами (після року збереження двома порівнюваними способами) насінь сільськогосподарських рослин: пшениця сорту «Федоровка», кукурудза сорту «ОДМА-310», огірок сорту «Конкурент» (від насінь до семиденних проростків ), при цьому титр клітин був на рівні n 107, а як контроль використовувалися насіння тих же рослин без інокуляції. Таблиця 1 Життєздатність штаму бактерій Cytophaga hutcinsonii у залежності від способу збереження чисельність життєздатних клітин (КУО) в 1мл суспензії, або в 1г носія термін збереження спосіб збереження спосіб-прототип: ліофілізація пропонований спосіб: іммобілізація на активованому вугіллі титр вихідної суспензии 6 місяців 1 рік 7,6 109 доба 6,4 108 5,1 106 5,3 104 7,6 109 7,3 108 6,8 107 5,8 107 При визначенні збереження фітостимулюючої активності отриману зазначеним способом бактеріальну суспензію з титром клітин не менш n 106 наносили на насіння випробуваних рослин і про рощували їх від насінь до семиденних проростків. Облік ефективності дії та збереження фітостимулюючої властивості випробуваного штаму проводили за основними критеріями ростового процесу 5 18431 рослин : енергія проростання (%), висота проростка (см), довжина кореня (см), біомаса одного проростка (г). Результати порівняння способу-прототипу і пропонованого способу по збереженню життєздатності представлені у таблиці 1. Порівнюючи результати збереження по прототипу та пропонованому способу можна зробити висновки: життєздатність штаму целлюлозолітичних бактерій Cytophaga hutcinsonii у процесі збереження багаторазово вище у випадку використання пропонованого способу, у порівнянні з прототипом. Цьому сприяє не тільки «м'які» умови сушіння після іммобілізації та, у зв'язку з цим відсутність стресу, але очевидно має значення і той факт, що перебування бактерій роду Cytophaga у іммобілізованому стані на дисперсному носії органічної (вугілля) природи в більшому ступені відповідає природним умовам середовища мешкання для цієї групи бактерій. При використанні відомого методу ліофілізації спостерігається достовірне (р