Тест-набір для діагностики бактеріального раку винограду

Тест-набір для діагностики бактеріального раку винограду, що містить два праймери у певних концентраціях, 4 дезоксинуклеозидтрифосфата (200 мМ кожного), Taq-полімеразу, реакційний бу 3 18430 збудником БРВ, що призводить врешті решт до зараження великих площ насаджень винограду у результаті швидкого поширення збудника контактним способом (інструмент при обрізуванні, обробці ґрунту і т.д.). Другим недоліком відомого тестнабору є складність процесу аналізу продуктів ампліфікації. До того ж у відомому тест-наборі використовуються великі кількості уживаних матеріалів, що збільшує вартість тест-набору. Розробка нового тест-набору для діагностики БРВ проводилася кафедрою мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. I.I. Мечникова згідно держзамовленню Міністерства освіти і науки України [ДЗ/165-05 наказ № 440 від 26.07.05]. В основу корисної моделі поставлено задачу збільшити надійність тестування і виключити можливість попадання при закладенні виноградників такого посадкового матеріалу винограду, який би містив збудника БРВ. Це досягається шляхом використання запропонованого тест-набору, що забезпечить підвищення надійності тестування і зменшить його собівартість. Технічний результат від застосування запропонованого тест-набору збільшення надійності тестування до 100%, спрощення процесу внесення продукту ампліфікації при електрофорезі), зменшення собівартості до 14 доларів США (в 3 рази у порівнянні з прототипом) внаслідок зменшення у 2,5 рази об'єму реакційної суміші і використання реагентів фірми "АмплиСенс" (Росія). Низька собівартість у свою чергу дозволить перевірити більшу кількість рослинного матеріалу. На перевірку 1000 рослин базового маточника за допомогою запропонованого тест-набору витрачається 14000 доларів США. Використання здорового посадкового матеріалу дозволить зберегти на насадженнях, що плодоносять тільки одного господарства площею 100га 52650грн щорічно, що окупить витрати на діагностику хвороби вже за два роки збирання урожаю. В Україні під виноградниками зайнято 83000га, і тестування дозволить запобігти збиткам у розмірі 43 млн гривень. Спільними ознаками прототипу і запропонованого тест-набору є наступні. Обидва тест-набори містять: - певний об'єм тест-набору; - два праймери; 4 - 4 дезоксинуклеозидтрифосфати (200мМ); - Taq-полімеразу; - реакційний буфер; - сульфат магнію. Відмінними ознаками прототипу і запропонованого тест-набору є наступні: - об'єм запропонованого тест-набору 20мкл замість 50мкл у прототипі; - концентрація двох праймерів у запропонованому тест-наборі по 0,5мкМ кожного замість 0,4мкМ у прототипі; - кількість одиниць Taq-полімерази у запропонованому тест-наборі 2Од Taq-полімерази замість 1Од у прототипі; - запропонований тест-набір містить реакційний буфер фірми "АмплиСенс" (Росія), який додатково містить крезоловий червоний і обважчувач, замість реакційного буферу фірми "Perkin-Elmer" (США); - концентрація сульфату магнію у запропонованому тест-наборі 2,0мМ замість 1,5мМ прототипа; Приклади використання запропонованого тестнабору. Приклад №1. Порівняльне випробування запропонованого тест-набору і прототипа проводили наступним чином. У запропонований тест-набір наступного складу (0,5мкМ кожного з двох праймерів, 200мМ кожного з 4 дезоксинуклеозидтрифосфатів, буфер з крезоловим червоним фірми "АмплиСенс" (Росія), 2мМ сульфату магнію) вносили різні кількості одиниць Taq-полімерази. Тестували ДНК ipt- і virD2-позитивних ппамів Agrobacterium tumefaciens FA2, A. tumefaciens C58, A. vitis ATI, наданих доктором Е. Szegedi (Угорщина) і доктором TJ. Burr (США). Надійність тестування була різною при використанні запропонованого тест-набору і прототипа. При цьому надійність тестування з використанням запропонованого тест-набору залежала від кількості одиниць Taq-полімерази. Результати представлені у таблиці 1. При внесенні 2 Од і 2,5 Од Taqполімерази надійність тестування склала 100%. Використання більшої кількості одиниць ферменту - 2,5 Од - не змінювало надійності, яка дорівнювала 100%, і у подальшому у запропонований тестнабір вносили тільки 2 Од Taq-полімерази. Таблиця 1 Результати випробування прототипу і запропонованого тест-набору в залежності від кількості одиниць Taq-полімерази у запропонованому тест-наборі Кількість одиниць Taq-полімерази у запропонованому тест-наборі 1 1,5 2 2,5 Тест-набір за прототипом Використання реакційного буфера фірми "АмплиСенс" (Росія) з крезоловим червоним і обважчувачем спрощує процес аналізу продуктів амплі Надійність тестування ipt- і virD2-позитивних штамів, % 75 89 100 100 92 фікації за рахунок того, що при внесенні у гель для електрофорезу немає необхідності додатково змішувати зразок з обважчувачем і фарбником. Це 5 18430 призводить до зменшення трудомісткості процесу. Приклад №2. Умови проведення випробувань такі ж, що і у прикладі 1. У тест-набір вносили 2 Од Taq 6 полімерази, але змінювали концентрацію сульфату магнію від 1,5 до 2,3мМ. Результати викладені у таблиці 2. Таблиця 2 Залежність надійності тестування від концентрації сульфату магнію у запропонованому тест-наборі Концентрація сульфату магнію у запропонованому тест-наборі, мМ 1,5 1,8 2 2,3 Надійність тестування ipt- і virD2-позитивних штамів, % Надійність тестування, як видно з таблиці 2, у випадку внесення у реакційну суміш 1,5мМ сульфату магнію складала 85% із-за недостатньої кількості ампліконів у низці повторностей, а у випадку 2,3мМ - 95% із-за утворення смуг неспецифічної ампліфікації. Надалі для тест-набору застосовували концентрацію сульфату магнію 2мМ, яка призводила до 100% надійності тестування. Запропонований тест-набір для діагностики бактеріального раку винограду у лозі, коренях, пасоці винограду, а також у ґрунті має перевагу у порівнянні з прототипом в отриманих технічних результатах - більш високій надійності тестування (100% для запропонованого тест-набору у порівнянні з 92% для прототипа). При цьому спрощується процес аналізу продуктів ампліфікації. Вар Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 85 92 100 95 тість запропонованого тест-набору дешевше у 3 рази (42 долара США - тест-набор за прототипом і 14 доларів США - запропонований тест-набір, див. прайс-лист, що додається). Ці характеристики нового тест-набору у порівнянні з прототипом забезпечують можливість широкого його застосування для запобігання поширення такої небезпечної хвороби як БРВ у виноградарських господарствах не тільки України, але й зарубіжних країн. Розроблений на кафедрі мікробіології і вірусології Одеського національного університету ім. I.I. Мечникова новий тест-набір був використаний для тестування рослинного матеріалу і ґрунту 21 господарства України і 6 господарств Республіки Молдова, і у найближчий час планується розширення обсягів його використання. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601