Процес виготовлення альгінатних капсул

Процес виготовлення альгінатних капсул, який включає формування двошарових альгінатних капсул, їх полімеризацію та промивання, який відрізняється тим, що на етапі полімеризації додатково перемішують розчин з капсулами на магнітній мішалці з частотою 60-90 об./хв. (19) (21) u200608091 (22) 18.07.2006 (24) 15.02.2007 (46) 15.02.2007, Бюл. № 2, 2007 р. (72) Пастер Ігор Петрович, Тронько Микола Дмитрович (73) ІНСТИТУТ ЕНДОКРИНОЛОГІЇ ТА ОБМІНУ РЕЧОВИН ІМ. В.П. КОМІС АРЕНКА АКАДЕМІЇ МЕ 3 20743 4 // Cell Transplant. - 2000. - Vol. 9, N 6. - P. 773-783]; Недоліком цього способу виготовлення альгіпропусканням через двохканальний генератор натних капсул, призначеного для мікроінкапсуляції крапель розчину альгінату (0,5%), інкубацією в тканини, також є недостатня стабільність альгінатрозчині хлориду кальцію (20ммоль/л), що містить них мікрокапсул до дії зовнішніх фізико-хімічних хлорид натрію (115ммоль/л) та гістидин чинників (зокрема, впливу механічних факторів, (5ммоль/л), протягом 10 хвилин для полімеризації, зміни осмоляльності розчину, підвищенння темпепісля чого капсули тричі послідовно промивають ратури середовища тощо). розчином хлориду натрія (0,9%) [Weber M., Steinert Таким чином, вказані недоліки знижують ефеA., Jork A. et al. Formation of cartilage matrix proteins ктивність функціонування альгінатних капсул, приby BMP-transfected murine mesenchymal stem cells значених для мікроінкапсуляції тканини або клітин. encapsulated in a novel class of alginates // В основу даної корисної моделі поставлено Biomaterials. - 2002. - Vol. 23, N 9. - P. 2003-2013]; задачу розробити такий процес виготовлення альвидавлюванням розчину натрію альгінату в деіонігінатних капсул, призначених для мікроінкапсуляції зованній двічі дистильованній воді (1-2%) через тканин або клітин, в якому за рахунок підбору техшприц з голкою для підшкірного введення з рівним нологічних режимів на одному з етапів приготукінчиком в 40мл розчину хлориду кальцію (50вання підвищується механічна та осмотична стій150ммоль/л) при перемішуванні на магнітній мішакість альгінатних капсул до дії зовнішніх фізиколці з швидкістю 5мл/хв протягом 20-30хв, після хімічних чинників (зокрема, впливу механічних чого капсули збирають фільтруванням розчину факторів, зміни осмоляльності розчину, підвищенхлориду кальцію, промивають деіонізованною воння температури середовища тощо). дою та висушують до сталої маси в вакуумній суПоставлена задача досягається тим, що в шці при кімнатній температурі протягом 36 годин процесі, який включає формування двошарових [Sankalia M.G., Mashru R.C., Sankalia J.M. and альгінатних капсул, їх полімеризацію та промиванSutariya V.B. Papain entrapment in alginate beads for ня, згідно з даною корисною моделлю, на етапі stability improvement and site-specific delivery: полімеризації в якості механічного впливу додатphysicochemical characterization and factorial ково застосовують перемішування розчину з капoptimization using neural network modeling // AAPS сулами на магнітній мішалці з частотою 60Pharm. Sci. Tech. - 2005. - Vol. 6, N 2. - P. E20990об/хв. E222]; видавлюванням розчину натрія альгінату в До даного рішення автори прийшли після доживильному середовищі F-12 (1,5%), що містить слідження фізичних характеристик альгінатних 10% інактивованої ембріональної сироватки крові капсул на всіх етапах виготовлення та виявленні теляти, крапля за краплею через голку в розчин, певної залежності стабільності капсул від додатщо містить хлорид кальцію (0,1ммоль/л) і хлорид кового механічного перемішування розчинів. На натрію (0,15ммоль/л), для 5-хвилинної полімеривідміну від прототипу, запропонований авторами зації, після чого капсули промивають розчином процес підвищення стабільності альгінатних капхлориду натрію [Wozniak P., Kozicki M., Rosiak J.M. сул перемішуванням на магнітній мішалці з частоet al. Alginate hydrogel - candidate support for cell тою 60-90об/хв дає можливість оптимізувати проtransplantation // e-Polymers. - 2005. - N 029. -P. 1цедуру ви готовлення альгінатних капсул. Даний 7]. механічний вплив є оптимальним, оскільки сприяє Проте, всі ці способи мають певні недоліки, кращому контакту іонів барія з альгінатними капоскільки більшість з них не забезпечує достатньої сулами та кращому проникненню іонів барія через стабільності альгінатних мікрокапсул до дії зовніповерхню цих капсул, що дозволяє значно прискошніх фізико-хімічних чинників (зокрема, впливу рити гелеутворюючі процеси в мікрокапсулах без механічних факторів, зміни осмоляльності розчиїх пошкодження, а також виключає можливість ну, підвищення температури середовища тощо). утворення конгломератів. За прототип авторами взято спосіб виготовПроцес здійснюється наступним чином. лення двошарових альгінатних капсул, призначеЧерез трьохканальний генератор альгінатних ний для мікроінкапсуляції тканини, який включає: капсул подаються два розчини альгінату різної а) формування капсул пропусканням через генеконцентрації (0,50% і 0,25%) та кисень із швидкісратор мікрокапсул з трьома соплами розчину альтю 6,0л/хв. Отримані альгінатні капсули інкубують гінату (0,25%) з швидкістю 0,03мл/хв (через перше в розчині хлориду барію (20ммоль/л, сопло), розчину альгінату (0,50%) з швидкістю 290мосмоль/л, рН 7,4) при додатковому постійно0,35мл/хв (через друге сопло) та кисню з швидкісму перемішуванні на магнітній мішалці з частотою тю 6,5л/хв (через третє сопло), б) полімеризацію 60-90об/хв протягом 15-20 хвилин, тричі промивакапсул інкубацією в розчині хлориду барію або ють в розчині хлориду натрію (0,9%, хлориду кальцію (20ммоль/л), що містить додатко290мосмоль/л), інкубують в розчині сульфату наво хлорид натрію (115ммоль/л) та гістидин трію (6ммоль/л, 290мосмоль/л) та повторно тричі (5ммоль/л), протягом 7-10 хвилин, та в) відмиванпромиванням в розчині хлориду натрію (0,9%, ня капсул багаторазовим промиванням в розчині 290мосмоль/л). Після отримання альгінатних капхлориду натрію (0,9%), додатковою інкубацією в сул вимірюють їх діаметри за допомогою світловорозчині сульфату натрію (6ммоль/л) та повторним го мікроскопа з окулярною вставкою, а також пробагаторазовим промиванням в розчині хлориду водять оцінку цілісності, механічної та осмотичної натрію (0,9%) [Jork A., Thurmer F., Cramer H. et al. стійкості та відбирають найбільш стабільні альгіBiocompatible alginate from freshly collected натні капсули [Пастер І.П., Тронько М.Д. Процес Laminaria pallida for implantation // Appl. Microbiol. визначення механічної стійкості альгінатних капBiotechnol. - 2000. - Vol. 53, N 2. - P. 224-229]. сул, призначених для мікроінкапсуляції тканин або 5 20743 6 клітин. 3. № u 2006 00288; Заявл. 12.01.2006; Пасроінкапсуляції тканин або клітин. 3. №u200600289; тер І.П., Тронько М.Д. Процес визначення осмотиЗаявл. 12.01.2006]. чної стійкості альгінатних капсул, призначених для Результати визначення механічної стійкості мікроінкапсуляції тканин або клітин. 3. альгінатних капсул показали, що 24-го динна інку№u200600289; Заявл. 12.01.2006]. бація призводить до збільшення розмірів капсул Приклад. Виготовлення альгінатних капсул з на 73% в першому досліді та 64% в другому досліметою отримання стабільних капсул, призначених ді (таблиця 1). Крім цього, в першому і другому для мікроінкапсуляції тканин або клітин. дослідах реєструється відповідно 38% і 27% поАльгінатні капсули готують як за стандартним шкоджених капсул. Наступна інкубація протягом методом [Zimmermann U., Cramer H., Jork A. et al. додаткових 72 годин не призводить до подальших Microencapsulation-based cell therapy // In.: суттєвих змін розмірів капсул. Biotechnology. Edited by Rehm H.-J. and Reed G. За результатами проведених досліджень меWeinheim: Wiley-VCH, 2001. - P. 548-571; ханічної стійкості можна зробити висновок, що в Zimmermann U., Thurmer F., Jork A. et al. A novel першому дослідженні альгінатні капсули були меclass of amitogenic alginate microcapsules for longханічно менш стійкі ніж альгінатні капсули в другоterm immunoisolated transplantation // Ann. N. Y. му дослідженні. Для подальшого використання Acad. Sci. - 2001. - Vol. 944. - P. 199-215] (перший рекомендовані альгінатні капсули з другого дослідослід), так і запропонованим методом, суть якого ду. полягає в додатковому постійному перемішуванні Результати визначення осмотичної стійкості на магнітній мішалці з частотою 60-90об/хв альгіпоказали, що в першому дослідженні 24-годинна натних капсул під час інкубації в розчині хлориду інкубація альгінатних капсул в розчині хлориду барію (20ммоль/л, 290мосмоль/л, рН 7,4) протягом натрію з осмоляльністю 300мосмоль/л в термоста15-20 хвилин на етапі полімеризації (другий доті при температурі 37°С не призводить до значного слід). Після отримання альгінатних капсул вимізростання розмірів капсул (таблиця 2). При 24рюють їх діаметри за допомогою світлового мікрогодинній інкубації в розчинах хлориду натрію з скопа з окулярною вставкою, а також проводять осмоляльністю 200, 100 і 0мосмоль/л розміри капоцінку цілісності, механічної та осмотичної стійкоссул зростають на 65%, 107% і 146% відповідно. ті та відбирають найбільш стабільні альгінатні капПри осмоляльності 100 і 0мосмоль/л реєструються сули [Пастер І.П., Тронько М.Д. Процес визначенвідповідно 3% і 7% пошкоджених капсулах. Настуня механічної стійкості альгінатних капсул, пна інкубація протягом додаткових 72 годин не призначених для мікроінкапсуляції тканин або кліпризводить до подальших суттєвих змін цілісності тин. 3. №u200600288; Заявл. 12.01.2006; Пастер та розмірів капсул. І.П., Тронько М.Д. Процес визначення осмотичної стійкості альгінатних капсул, призначених для мікТаблиця 1 NN Показник, який досліджується 1 2 Діаметр капсул (мм) Інтактні капсули (%) 1 2 Діаметр капсул (мм) Інтактні капсули (%) Тривалість інкубації 0 годин 24 години Перший дослід 2,27±0,06 3,92±0,15* 100,0 62,0 Другий дослід 2,28±0,07 3,74±0,14* 100,0 73,0 96 годин 4,27±0,08 * 54,0 3,98±0,11 * 65,0 Примітка. * - Р < 0,001 порівняно з 0 годин інкубації. Результати другого дослідження показали, що 24-годинна інкубація альгінатних капсул в розчинах хлориду натрію призводить до вірогідного зростання розмірів капсул на 44-113% при осмоляльності розчинів від 0 до 200мосмоль/л (таблиця 2). В подальшому розміри капсул залишаються без суттєвих змін. При умовах інкубації, які розроблені в даній корисній моделі, всі капсули в другому досліді мають цілісну структур у. За результатами проведених досліджень ос мотичної стійкості можна зробити висновок, що в першому дослідженні альгінатні капсули були осмотичне не стійкі, на відміну від альгінатних капсул в другому дослідженні, які можна охарактеризувати як осмотичне стійкі. Для подальшого використання рекомендовані альгінатні капсули з другого досліду. Дослідження достатньо проводити після 24 годин інкубації, оскільки в подальшому суттєвих змін досліджуваних показників не відбувається. 7 20743 8 Таблиця 2 NN Осмоляльність розчину, мосмоль/л 1 2 3 4 300 200 100 0 1 2 3 4 300 200 100 0 Розміри альгінатних капсул залежно від часу інкубації(мм) 0 годин 24 години 96 годин Перший дослід 2,30±0,08 2,80±0,08* 2,90±0,12* 2,30±0,08 3,80±0,15* 4,15±0,08* 2,25±0,08 4,65±0,13* 4,95±0,12* 2,30±0,08 5,65±0,08* 5,85±0,08* Другий дослід 2,29±0,07 2,57±0,11** 2,68±0,11** 2,32±0,06 3,35±0,14* 3,61±0,21* 2,30±0,12 4,14±0,12* 4,36±0,17* 2,30±0,09 4,91±0,20* 5,02±0,23* Примітка. * - Р < 0,001 і * - Р < 0,05 порівняно з 0 годин інкубації. Таким чином, запропонований авторами процес виготовлення альгінатних капсул, призначених для мікроінкапсуляції тканин або клітин, дозволяє Комп’ютерна в ерстка А. Крижанівський підвищити механічну і осмотичну стійкість альгінатних капсул та досягти максимального ефекту мікроінкапсуляції тканин або клітин. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601