Спосіб культивування стовбурових клітин ссавців

Спосіб культивування стовбурови х клітин ссавців, що включає вирощування клітин у первинній культурі, спрямоване диференціювання клітинпопередників шляхом додавання речовиніндукторів та фенотипування культури клітин за 3 25184 macromolecules. - 2003. - Vol.4, №6. - P.1733-1739; Serafica G., Mormino R., Bungay H. Inclusion of solid particles in bacterial cellulose // Applied microbiology and biotechnology. - 2002. - Vol.58, №6. - Р.756760]. Серед методів класичного культивування можна виділити капілярний метод - вирощування клітин у мікросередовищі капілярних трубок або в мікрокраплі живильного середовища багатолункової полістиренової пластинки. Клітини, що із часом утворюють густий моношар, потребують обов'язкового субкультивування [Sanford К.К. Capillary techniques // Tissue culture, methods and applications. Ch.7. - New York: Academic Press Inc., 1973. - P.237-241; MacPherson L.A. Soft agar technique // Tissue culture, methods and applications. Ch.7. - New York: Academic Press Inc., 1973. – P.276-281]. Відповідно до іншого методу за Copper J.E.K. й співавт., суспензію клітин розводять до концентрації 10 клітин в 1мл. За певних умов клітини можуть утворювати колонії, будучи не прикріпленими до скляного або пластикового субстрату, а суспендованими в напіврідкому агарі [Cooper J.E.K. Microtitre tests a single cell clones// Tissue culture, methods and applications. - New York: Academic Press Inc., 1973. - P.266-268; Critchley D.R., MacPherson I. Cell density dependent glycolipids in NILz hamster cells, derived malignant and transformed cell lines // Biochimica et biophysica acta. 1973. - Vol.296, №1. - P.145-159]. До традиційного культивування також можна віднести клонування клітин на "фідерному шарі" із використанням шару фідерних клітин, що підтримує їхнє виживання за рахунок секреції в культуру ростових факторів та блокує прямий контакт із підложкою, адгезія з якою є сигналом до початку синтезу білків цитоскелету та спонтанного диференціювання. В якості фідерного шару клітин, звичайно, використовуються ембріональні фібробласти миші, оброблені антимітогеном (мітоміцин С) [Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts / J.A. Thomson, J. Itskovitz-Eldor, S.S. Shapiro et al. // Science. - 1998. - Vоl.282, №5391. Р.1145-1147]. Багатьма дослідниками застосовується метод сулій, що обертаються, або ролерного культивування, за якого клітинний моношар розташовується по всій циліндричній поверхні горизонтально судин, що обертаються, та періодично обмивається живильним середовищем. Для ролерного культивування використовуються спеціальні стелажноярусні апарати для сулій, що обертаються, або барабани [Gamma-Linolenic acid production by solid-state fermentation of Mucorales strains on cereals / E. Conti, M. Stredansky, S. Stredanska, F. Zanetti // Bioresource technology. - 2001. - Vol.76, №3. - P.283-286]. Методика культивування з використанням скляних трубок Bellco-Corbeil Culture System (Belico Glass Inc., США) була спочатку розроблена Корбейлом. Суть методу полягає в тому, що в сулію, що обертається, поміщають пучок паралельно розташованих дрібних скляних трубок, розділених силіконовими прокладними кільцями. Судина 4 перфузується живильним середовищем із зовнішнього резервуара. Оригінальність системи полягає в чергуванні обертання на 360° за та проти годинникової стрілки. Це дозволяє відмовитися від використання спеціальних кришок для підведення перфузійного живильного середовища [An improved metaphase index assay for detecting thyroid growth stimulators using FRTL-5 thyroid cells cultured on a microtitre plate / P.A. Ealey, S.D. Mitchell, P.M. Rowles, N.J. Marshall // Journal of immunological methods. - 1988. - Vol.111, №1. P.117-123]. Методика культивування з використанням пластикових мішків використовує біологічно інертні пластикові мішки, які характеризуються дуже високою проникністю для газів та виготовляються із фтор-етилен-пропіленового сополімеру FEP-teflon (Du Pont de Nemours, Женева, Швейцарія). Система забезпечує достатнє живлення культури киснем, що дозволяє одержати високу густину клітин. Культура поміщається на качалку або обертається для підтримки однорідності середовища [Julak J. Chromatographic analysis in bacteriologic diagnostics of blood cultures, exudates, and bronchoalveolar lavages // Prague medical report. - 2005. - Vol.106, №2. - P.175-194; Baghaban Eslami Nejad M.R., Rezazadeh Valojerdi M., Kazemi Ashtiani S. A comparison of polarized and non-polarized human endometrial monolayer culture systems on murine embryo development // Journal of experimental & clinical assisted reproduction. - 2005. - Vol.2, №1. P.7; Characteristics of human chondrocytes, osteoblasts and flbroblasts seeded onto a type I/III collagen sponge under different culture conditions. A light, scanning and transmission electron microscopy study / M. Fuss, E.M. Ehlers, M. Russlies // Annals of anatomy. - 2000. - Vol.182, №4. - P.303-310]. При вирощуванні клітин за допомогою культиватора із пластиковою плівкою IL-410 використовують такий самий матеріал (FEP-teflon), але не у вигляді мішків, а у вигляді довгих трубок, накручених із прокладками на котушку. Середовище помпується через трубки й може або видалятися, або рециркулювати через зовнішній резервуар. Газообмін між середовищем та повітряним простором термостата здійснюється через стінки трубок [Little J.L., Bennett D.R., Miller J.J. Nutrient and sediment losses under simulated rainfall following manure incorporation by different methods // Journal of environmental quality. - 2005. - Vol.34, №5. - P.18831895; Trichloroethylene (TCE) removal in a single pulse suspension bioreactor/ V. Volcik, J. Hoffmann, J. Ruzicka, M. Sergejevova // Journal of environmental management. - 2005. - Vol.74, №4. P.293-304]. Біореактор зі скляним намистом для вирощування клітин складається з підложки зі скляного намиста діаметром 3-5мм, крізь яку безупинно протікає живильне середовище [Whiteside J.P., Spier R.E. The scale-up from 0,1 to 100 litre of a unit process system based on 3mm diameter glass spheres for the production of four strains of FMDV from BHK monolayer cells // Biotechnology and Bioengineenng. - 1987. - Vol.23. - P.551-557]. 5 25184 Культуральна система "OptiCell" (BioCrystal Ltd., США) для росту клітин використовує керамічний матеріал. Вона складається із циліндричного керамічного патрона з каналами площею 1мм 2 по всій довжині циліндра. Систему доповнює перфузійний контур, кінцева частина якого занурена в зовнішній резервуар, де здійснюється контроль якості середовища. Система забезпечує високе відношення робочої поверхні до об'єму (40:1) [A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion / H.S. Duong, A.D. Le, Q. Zhang, D.V. Messadi // International journal of experimental pathology. 2005. - Vol.86, №6. - P.365-374]. Традиційним способом культивування клітинного матеріалу є спосіб із застосуванням загальнопоширеного середовища MEM з сироваткою при забезпеченні підвищеної концентрації СO2 до 5% при термостатуванні та наявності фідерного шару клітин [Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков: Пер. с англ. / Пер. М.А. Панова: Под ред. В.Ю. Полякова. - Москва: Мир, 1983. - 263с.]. Даний спосіб культивування стовбурних клітин є найбільш близьким до того, що заявляється по технічній суті та результату, який може бути досягнутим, тому його обрано в якості найближчого аналога. Головним недоліком способу-найближчого аналога та відомих аналогів є їх складність, незабезпечення в багатьох випадках однорідної за фенотиповими ознаками популяції стовбурних клітин плюрипотентного класу та достатньої кількості клітинної маси. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі покладено задачу спрощення способу культивування стовбурних клітин та збільшення кількості клітинної маси при забезпеченні її однорідності за фенотиповими ознаками. Задачу, яку покладено в основу корисної моделі, вирішують тим, що у відомому способі культивування стовбурних клітин, який включає вирощування клітин у первинній культурі, спрямоване диференціювання клітин-попередників шляхом додавання речовин-індукторів та фенотипування культури клітин за імуноцитохімічним методом, згідно з корисною моделлю, культивування здійснюють на 2% агар-агаровому матриксі при температурі 37,0±0,2°С із застосуванням живильного середовища із 10% сироваткою ембріона теляти, яке оновлюють в перебігу процедури до 25-30% в електричному сухоповітряному термостаті за природних параметрів газоповітряного середовища і вологості, стерильність культури протягом усього терміну культивування забезпечують сумісним використанням тіазолвмісних сполук та препаратів із групи аміноглікозидів. Технічний ефект корисної моделі полягає в технологічній простоті способу культивування, його низькій собівартості, більш якісній кінцевій культурі та більшій її масі, відсутності дорогого обладнання та стерильних боксів. Досягти цього дозволяє використання при культуральних операціях поширеного разового стерильного інструментарію (разові шприци, хірургічні рукавички тощо); дезагрегація первинного клітинного матеріалу (на 6 приклад, тканини кісткового мозку) за допомогою стерильних разових систем для трансфузій; використання агар-агарового матриксу, що оброблений за спеціальною технологією; використання тіазолвмісних сполук для знезаражування протягом довготермінового культивування без пере посівів; здійснення культивування за природних параметрів газоповітряного середовища та вологості. Спосіб здійснюють наступним чином: У дослідах in vitro для одержання культури СК плюрипотентного класу використовують кістковий мозок стегнових кісток ссавців. Суспензію клітин кісткового мозку ссавців виділяють відразу після декапітації під пентобарбіталовим наркозом із використанням внутрішньочеревного введення 40мг/кг пентобарбіталу натрію. У стерильних умовах видаляють епіфізи стегнових кісток ссавців, а діафізи промивають 0,5мл живильного середовища MEM із додаванням 20% сироватки крові ембріонів корів за допомогою голки 16 G, насадженої на шприц. Отриманий змив первинного клітинного матеріалу кісткового мозку ссавців висівають на пластикові чашки Петрі (Sarstedt, Німеччина) або стерильні 6-лункові пластикові планшети та вирощують на 2% агар-агаровому (агар-агар мікробіологічний, ЗАТ "Хімреактив", Росія) матриксі при температурі 37,0±0,2°С (термостат електричний сухоповітряний ТС-80, Росія) протягом шести тижнів після експлантації з використанням селективного живильного середовища (СЖС). Культивування здійснюють за природних параметрів газоповітряного середовища і вологості та з додаванням 10% сироватки ембріона теляти (ТОВ "Біолот", Росія). СЖС конструюють на основі стерильного фосфатно-сольового буферного розчину Хенкса з рН 7,4 (ТОВ "Біолот", Росія) з індикаторним барвником феноловим червоним, що змінює забарвлення з яскраво-червоного (у свіжому середовище) до жовто-жовтогарячого (у середовище з культивованими протягом деякого часу клітинами). Стерильність культури протягом усього терміну культивування забезпечується сумісним використанням тіазолвмісних сполук та препаратів із групи аміногликозидів. Для одержання даних про посадкову концентрацію клітинного матеріалу після дезагрегації тканини кісткового мозку ссавців відбирають шість порцій клітинного аспірату по 1мл кожна. Кожну порцію вносять в градуйовані конусні центрифужні пробірки з 3мл живильного розчину MEM без сироватки й тричі піддають центрифугуванню при 1000об/хв. протягом 5хв. Після кожного центрифугування проводять відбір надосадової рідини зі збереженням 1мл її залишкового об'єму, а осад ресуспендують механічним зняттям клітин скляною паличкою з гумовим наконечником і додаванням свіжого живильного розчину MEM без сироватки в об'ємі 3мл. Після останньої процедури центрифугування, відбору надосадової рідини й механічного ресуспендування, клітини отриманої суспензії (1мл) підраховують в лічильній камері Горяєва за стандартною методикою. Ферментну дисоціацію клітин досягають шляхом промивання моношару фосфатним сольовим 7 25184 буфером (ФСБ) або ФСБ з 1мМ ЕДТА та наступною інкубацією з холодним розчином трипсину протягом 30с з подальшим його видаленням. Клітини потім додатково інкубують протягом 15хв. та суспендують в живильному розчині. Для механічного збору клітин використовують спеціальні шкребки з гумовими наконечниками, що випускаються фірмою Mac-Farlane Robson Ltd. (Великобританія). Ці гумові наконечники одягають на кінчик скляної палички, утворюючи м'яку поверхню. За допомогою скляної палички клітини відскрібають із субстрату. Для знімання клітин із поверхні матриксу чашок Петрі або 6-лункових планшетів використовують також клинчики із силіконової гуми. Стерилізацію шкребків та клинчиків здійснюють автоклавуванням. Після дисоціації (ферментної, за допомогою 0,01% розчину трипсину, або механічної) клітин отриману клітинну суспензію тричі відмивають центрифугуванням і ресуспендують у свіжому живильному розчині MEM без сироватки, як зазначено раніше, потім оцінюють стан клітинної культури, тобто підраховують загальну кількість клітин, а також виявляють в їхньому числі мертві й живі клітини (0,1% розчин барвника трипанового синього забарвлює тільки мертві клітини). Однорідність клітинної суспензії за кількістю клітин на одиницю об'єму досягають використанням магнітної мішалки ММ-01 лабораторної (Гомель, Білорусь). Підрахунок клітин виконують за допомогою лічильної камери Горяєва за стандартною методикою. Спосіб ілюструє наступний приклад: Приклад У дослідах in vitro для одержання культури СК плюрипотентного класу використовувався кістковий мозок стегнових кісток статевозрілих щурівсамців лінії Wistar-Kyoto 5 особин масою 400-450г, що втримувалися на брикетованих кормах за умов віварію. Видалення кісткового мозку ссавців здійснювали відповідно до національних "Загальних етичних принципів дослідів на тваринах" (Україна, 2001), що відповідає положенням "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних і інших наукових цілей" (Страсбург, 18.03.1986р.). Суспензію клітин кісткового мозку ссавців виділяли відразу після декапітації під пентобарбіта Комп’ютерна в ерстка А. Рябко 8 ловим наркозом із використанням внутрішньочеревного введення 40мг/кг пентобарбіталу натрію. У стерильних умовах видаляли епіфізи стегнових кісток ссавців, а діафізи промивали 0,5мл живильного середовища MEM із додаванням 10% сироватки крові ембріонів телят за допомогою голки 16 G, насадженої на шприц. Отриманий із зазначеного джерела клітинний матеріал надалі вирощували 6 тижнів на відповідному застосованому методу культивування (селективному та традиційному за Адамс Р.) субстраті (матриксі) при температурі 37,0±0,2°С (термостат сухоповітряний ТС-80, Росія). Перша модель культивування по заявленому способу проводилася на 2% агар-агаровому матриксі із застосуванням селективного живильного середовища з сироваткою за природних параметрів газоповітряного середовища й вологості. Друга модель проводилася за традиційною методикою культивування клітинного матеріалу із застосуванням загальнопоширеного середовища MEM с сироваткою при забезпеченні підвищеної концентрації СО2 до 5% при термостатуванні та наявності фідерного "шару" клітин (Adams R.L.P, 1983). Перша модель культивування потребувала лише часткове її оновлення до 25%-30%, проте як друга вимагала обов'язкових періодичних перепосівів (субк ультивувань). Протягом усього терміну вирощування проводили фенотипування субпопуляційної структури культури клітин в обох моделях культивування за імуноцитохімічним методом (Пинчук В.Г. й співавт., 1990), що запроваджений Інститутом експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кравецького (Київ, Україна). Слід зазначити гетерогенну природу отриманого за 6 тижнів клітинного матеріалу при використанні традиційного метода культивування. Навпаки, запропонована методика дозволила одержати протягом 6 тижнів більше клітинної маси (в 9,2 рази) зі збереженням високої життєздатності клітин (в 1,4 рази) в порівнянні з найближчим аналогом та більш якісний її популяційний склад (висока морфологічна та фенотипова однорідність культури з мінімальним вмістом баластових клітин). Таким чином, отримана однорідна за фенотиповими ознаками селективна культура СК плюрипотентного класу. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601