Спосіб дослідження розчинів кріопротекторів при заморожуванні

Спосіб дослідження розчинів кріопротекторів при заморожувані, який включає охолодження зразків розчинів кріопротекторів та експериментальне визначення їх фізичних характеристик, який відрізняється тим, що охолодження здійснюють до температури вище температури їх склування, після охолодження зразки піддають деформації 3 ти висновки щодо відносного розташування кристалічної та аморфної фаз в усьому об'ємі зразка, і визначити порогову концентрацію кріопротектору, починаючи з якої у біологічних об'єктах під час їх заморожування формується структура зразка у вигляді кристалічної матриці з безперервними аморфними прошарками. Використання у практиці кріоконсервування порогових концентрацій кріопротектору виключає можливість утворення структури заморожуваного зразка з локальними замкнутими включеннями і тим самим дозволяє підвищити збереженість біологічного матеріалу при кріоконсервуванні. Ця задача вирішується тим, що у способі дослідження розчинів кріопротекторів при заморожувані, який включає охолодження зразків розчинів кріопротекторів та експериментальне визначення їх фізичних характеристик, згідно з корисною моделлю, охолодження здійснюють до температури вище температури їх склування, після охолодження зразки піддають деформації шляхом послідовного прикладання зовнішніх навантажень через задані проміжки часу та реєструють залежність деформації зразків від часу, далі будують криві напруг-деформацій та сумарного прирощення спричиненої послідовними навантаженнями пластичної деформації зразків від концентрації кріопротектору, потім визначають залежність межі текучості зразків від концентрації кріопротектору і по зміненню цих показників роблять висновки відносно структури зразка щодо розташування кристалічної та аморфної фаз в усьому об'ємі зразка і визначають порогову концентрацію кріопротектору, яка забезпечує перехід локальних замкнутих включень у безперервні прошарки. Заявлений спосіб дозволяє визначати порогові концентрації будь-яких кріопротекторів, які використовуються для кріоконсервування біологічних об'єктів, і, таким чином, зменшити їх механічне пошкодження та забезпечити одержання високих показників біологічної повноцінності заморожуваного матеріалу. Спосіб здійснюють таким чином. Зразки водного розчину кріопротектору різної концентрації поміщають в спеціальний деформаційний пристрій для дослідження термопластичних властивостей [2], охолоджують зі швидкістю 45°С/хв до температури вище температури склування відповідного зразка на 30°С, стабілізують його при цій температурі протягом 10 хвилин, потім прикладають до зразка зовнішні навантаження Р через строго задані проміжки часу. Величину зовнішніх навантажень вибирають виходячи з умови Р≤sтiк(T)xS, де S - площа поперечного перетину зразка у площині зсуву, sтік - межа текучості охолодженого зразка при заданій температурі. Далі реєструють залежність деформації зразка від часу s=f(e). На підставі отриманих експериментальних кривих будують криві напруг-деформацій s=f(e), а також визначають величину сумарного збільшення пластичної деформації зразка між послідовними навантаженнями DeS. З побудованих кривих s=f(e) визначають межу текучості водних розчинів криопротекторів sтік. Після цього будують залежність межи текучості зразків від концентрації 26502 4 кріопротекторів sтiк=f(C) та залежність сумарного збільшення пластичної деформації зразків між послідовними навантаженнями від концентрації кріопротектора De S=f(C). Різке зменшення величини sтік та різке зростання величини De S на залежностях sтiк=f(C) та De S=f(C), відповідно, свідчать про чисельне значення порогових концентрацій досліджених зразків. Здійснення способу пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. В якості зразків брали водні розчини кріопротекторів диметилсульфоксиду (ДМСО), гліцерину та поліетиленоксиду з молекулярною масою 1500 (ПЕО-1500) у концентраціях 0, 3, 5, 6, 7, 10, 15%. Зразки по черзі поміщали в спеціальний деформаційний пристрій для дослідження термопластичних властивостей, охолоджували зі швидкістю 4-5°С/хв до температури вище температури склування відповідного зразка на 30°С, стабілізували його при цій температурі протягом 10 хвилин, потім прикладали до зразка зовнішні навантаження Р через задані проміжки часу, однакові для всіх кріопротекторів. Реєстрацію деформаційних кривих e=f(t) проводили при постійній температурі, яка для водних розчинів ДМСО склала -90°С, для водних розчинів гліцерину - -70°С та для водних розчинів ПЕО-1500 - -50°С. Криві напруг-деформацій s=f(e) для цих кріопротекторів представлені на фігурах 1, 2, 3, відповідно. Побудовані залежності sтiк=f(C) для водних розчинів ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 представлені на фігурах 4, 5, 6, відповідно. Для всіх трьох кріопротекторів спостерігається різке зниження межи текучості при порогових концентраціях: 5% - для водних розчинів ДМСО, 6% - для водних розчинів ПЕО-1500 та 7% - для водних розчинів гліцерину. Для цих кріопротекторів будували залежності DeS=f(C), які зображені на фігурах 7, 8, 9, де спостерігається таке ж різке зростання сумарного збільшення пластичної деформації зразків між послідовними навантаженнями для всіх кріопротекторів при тих самих концентраціях, що підтверджує вірність численного значення порогових концентрацій. Отже для водних розчинів ДМСО порогова концентрація становить 5%, для водних розчинів ПЕО-1500 - 6% і для водних розчинів гліцерину 7%. Приклад 2. Для підтвердження ефективності використання порогових концентрацій при кріоконсервуванні біологічних об'єктів проводили заморожування клітин Saccharomyces cerevisiae з водними розчинами кріопротекторів 5% ДМСО, 7% гліцерину та 6% ПЕО-1500 у відповідних концентраціях. Saccharomyces cerevisiae вирощували протягом 48 годин при +30°С на агаризованому середовищі Сабуро. Потім підрощували в рідкому середовищі Сабуро протягом 24 годин з аерацією. Після підрощування дріжджові клітини осаджували центрифугуванням і ресуспендували в середовищах консервування: водних розчинах ДМСО, гліцерину і ПЕО-1500 з концентраціями 3, 5, 6, 7, 10 та 15%. Охолоджували усі зразки зі швидкістю 1°С/хв до -40°С з наступним зануренням у рідкий азот. Відігрівали зразки на водяній бані при +37°С до зникнення твердої фази. Життєздатність дріж 5 26502 джових клітин визначали чашковим методом Коха [3] по кількості макроколоній, що сформувалися на агаризованих середовищах. Серійні розведення клітинних суспензій проводили в 9% водяному розчині NaCl. У якості контролю брали суспензії клітин у відповідних середовищах консервування, що не підлягали заморожуванню. Життєздатність 6 клітин після заморожування-відігріву в присутності кріопротекторів ДМСО, ПЕО-1500 та гліцерину відображена у Таблиці, з якої видно, що при досягненні концентрацій кріопротекторів порогових значень (5, 6 і 7%, відповідно) цей показник підвищується. Таблиця Життєздатність клітин Saccharomyces cerevisiae (% від контролю) після заморожування та відігріву в залежності від концентрацій кріопротекторів. Концентрація кріопротектора, % 0 3 5 6 7 10 15 ДМСО 4,8±0,5 7,4±0,3 32,6±0,2 38,4±0,2 44,4±0,2 50,8±0,2 57,4±0,4 Джерела інформації: 1. Рєзніков В.І., Кирилюк Г.Л. Спосіб дослідження розчинів охолоджуваних кріопротекторів. Патент України №18660, G01N25/02, 15.11.2006. 2. Осецкий А.И. Кирилюк А.Л., Турина Т.М. Изучение кинетики расстеклования водных раст Кріопротектор Гліцерин 72±0,2 74,1±0,4 80,1±0,2 80,3±0,2 98,3±0,3 98,3±0,4 98,2±0,3 ПЕО-1500 56±0,4 75,3±0,2 77±0,37 94,2±0,2 95,6±0,1 95,0±0,2 95,1±0,4 воров криопротекторов методом термопластической деформации // Пробл. криобиологии. - 2005. т.15, №2. - с. 137 - 146. 3. Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов: Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1990 - 186с. 7 Комп’ютерна верстка О. Рябко 26502 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601