Спосіб підвищення продукування протеїну с, спосіб підвищення рівня його модифікації

1. Способ повышения продуцирования протеина С при культивировании аденовируотрансформированных рекомбинантных клеток млекопитающих, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что культивирование осуществляют при температуре около 39°С, а упомянутые клетки выбирают из группы, включающей рекомбинантные клетки AV 12 и рекомбинантные клетки 293. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что используют рекомбинантные клетки AV 12. 3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что используют рекомбинантные клетки 293. 4. Способ повышения уровня гаммакарбоксилирования рекомбинантного протеина С, полученного при культивировании аденовирустрансформированных рекомбинантных клеток млекопитающих, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что культивирование осуществляют при температуре около 39°С, а в качестве упомянутых клеток используют рекомбинантные клетки AV 12. оо Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности, к способам продуцирования высоких уровней функционального рекомбинантного протеина С в клеточных линиях млекопитающих. Многие протеины подвергаются значительной пост-трансляционной модификации в процессе созревания Человеческий протеин С (ЧПС) (human protein С НРС, пер.) гамма-карбоксилируется, бета-карбоксилируется и гликозилируется либо в процессе, либо сразу после трансляции первичной РНК матрицы. Многие линии клеток, такие как клеточная линия AV 12 сирийского хомяка, являются неспособными эффективно осуществлять эти пост-трансляционные модификации, поэтому молекулы протеина С, продуцированные в этих клетках, не полностью функциональны. Другие линии клеток, такие как клеточная линия 293 человеческой почки, продуцируют полностью функциональные молекулы протеина С, но уровни экспрессии молекул протеина С в этих клетках являются довольно низкими. Настоящее изобретение относится к способам повышения уровня продуцирования полностью функционального протеина С в таких клеточных линиях, которые обычно не продуцируют полностью функциональные молекулы. Изобретение также относится к способам повышения уровня общего про о 26870 дуцирования молекул протеина С в таких клеточных линиях, которые обычно продуцируют полностью функциональные молекулы. Способы по настоящему изобретению касаются культивирования продуцирующих прогеин С клеточных линий при температурах, более высоких, чем обычная температура инкубации 37°С. В изобретении определены ниже следующие термины. Аденовирус - трансформированная клеточная линия - линия клеток, которая производит EIA генный продукт аденовируса. Человеческий протеин С - зимоген человеческого протеина С и активированный человеческий протеин С. Насцентный протеин - полипептид, продуцируемый при трансляции мРНК, до каких-либо пост/трансляционных модификаций. Однако посттрансляционные модификации, такие как гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты и гидроксилирование остатков аспарагиновой кислоты могут начинать происходить перед тем, как протеин полностью транслирован с транкрипта сРНК. Активность протеина С - любое свойство человеческого протеина С, отвечающее за протеолитическую, амидолитическую, эфиролитическую и биологическую (антикоагулянтную или профибринолитическую) активности. Способы определения протеин антикоагулирующей активности хорошо известны специалистам (Gnnnell et al., 1987, Bio/Technology 5:11891192).' Зимоген - биокаталитически неактивный предшественник протеолитического фермента. Зимоген протеина С, используемый здесь, относится к секреторным, неактивным формам, либо одной цепи, либо двух цепей протеина С. Все аббревиатуры аминокислот, используемые в этом описании, такие же, как и в Патенте Соединенных Штатов и Trademark Office, представленные в 37 C.F.R. 1.822 (о) (2) (1990). Изобретение относится к способу продуцирования протеина С в аденовирустрансформированных рекомбинантных хозяйских клетках млекопитающих. Способ включает культивирование аденовирустрансформированных рекомбинантных хозяйских клеток млекопитающих при температуре между 38 и 39°С. Изобретение относится также к способу повышения продуцирования функционального протеина С в аденовирустрансформированных рекомбинантных хозяйских клетках мле копитающих, включающего культивирование клетки хозяина при температуре между 38 и 39°С. Для продуцирования рекомбинантного 5 человеческого протеина С использовались многие различные клеточные линии. Однако поскольку молекула человеческого протеина С подвергается значительной посттрансляционной модификации, наибо10 лее общепринятые клеточные линии или не продуцируют полностью функциональный протеин С, или, если полностью функциональный протэин С продуцирован клеточной линией, уровень экспрессии или 15 секреции остается относительно низким. Например, клеточная линия AV 12 сирийского хомяка обычно не может продуцировать молекулы протеина С, которые содержат все девять остатков гамма-кар20 боксиглутаминовой кислоты, требуемые для полной активности. С другой стороны, молекулы протеина С, продуцированные в клетках 293 почки эмбриона человека, являются, главным образом, полностью гам25 ма-карбоксилированными и бета-гидроксилированными, хотя уровни продуцирования человеческого протеина С этими клеточными линиями относительно низкие. 30 Обычно культуры клеток млекопитающих инкубируют при 37°С. Когда аденовирус-трансформированную клеточную линию AV 12-664 сирийского хомяка (АТСС CRL 9595), содержащую плазмиду, коди35 рующую ген человеческого протеина С, - инкубируют при 37°С, клеточная линия продуцирует протеин С, который гамма-карбоксилирован только на 40-50%, что приводит к низкой функциональности протеи40 на С в неочищенной культурной среде. Когда эту же самую клеточную линию инкубируют при 38,5-39°С, функционально-антикоагулянтная активность секретированного протеина С в кондициониро45 ванной культурной среде увеличивается. Скорость секреции протеина С из этой клеточной линии, инкубированной при повышенной температуре была на 20-30% ниже чем скорость секреции при 37°С, 50 хотя это понижение скорости секреции компенсировалось повышением функциональности секретированного протеина С. Клетки 293 человеческой почки (АТСС CRL 1573) являются трансформированны55 ми первичными клетками почки эмбриона человека, которые содержат и экспрессируют трансформирующей ген аденовируса 5. Эти клетки были использованы для экспрессии некоторых важных генных продуктов и применялись рядом различных 26870 лабораторий как в научных учреждениях, так и в промышленности. Например, Yan, U.S. Patent № 4981952 и Bang et a!., U.S. Patent № 4992373, описывают использование клеточной линии 293 для продуцирования человеческого протеина С. Клеточная линия 293 почки эмбриона человека секретирует полностью гамма-карбоксилированный человеческий протеин С, когда несет экспрессирующую плазмиду, кодирующую ген человеческого протеина С. Культивированная при 37°С эта линия клеток 293 секретировала человеческий протеин С со специфической активностью приблизительно 350 U/мг. Повышение температуры роста этих рекомбинантных клеток 293 не приводит к повышению функциональности секретированного протеина С (так как протеин С из этой клеточной линии уже полностью гамма-карбоксилирован). Однако рекомбинантные клетки 293, выращенные при 38-39°С, показывают повышение скорости секреции протеина С по сравнению с теми же клетками, выращенными при 37°С. В соответствии с описанием изобретения повышение продуцирования протеина С может означать либо повышение в целом секреции протеина С из клеточной линии, либо повышение функциональности секретированного протеина С. Изобретение не ограничено использованием аденовирус-трансформированной клеточной линии почки эмбриона человека или аденовирус-трансформированной клеточной линии AV12-664 сирийского хомяка. Большое число клеточных линий млекопитающих способно продуцировать человеческий протеин С. Например, клеточная линия HepG2 является линией клеток печени человека, которая была использована для продуцирования человеческого протеина С. Клеточная линия ВНК (Baby Hamster Kidney - почка детеныша хомяка), клеточная линия SA7, клеточная линия SV20, клеточная линия FAZA и клеточная линия МК2 были также использованы для продуцирования протеина С. Хотя не все перечисленные клеточные линии являются аденовирус-трансформированными клеточными линиями, специалисту понятно, что многие клеточные линии млекопитающих могут быть трансформированы аденовирусом для создания специфической аденовирус-трансформированной линии клеток, которая может быть использована в способе по изобретению. Настоящее изобретение не ограничивается только температурами 38 и 39°С. Большинство ферментативных процессов 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 у млекопитающих протекает при 37С'С, хотя было обнаружено, что температура ферментации около 38°С приводит к повышенному продуцированию протеина С в аденовирус-трансформированных клетках. При том, что во многих ферментерах и термостатах температуры могут колебать ся на 0,5°С, термин "около" может рассматриваться как температура в пределах 0,5°С от исходной температуры. Поэтому термин "около" 38°С может подразумевать от 37,5 до 38,5°С. Термин "около" 39°С может подразумевать от 38,5 до 39,5°С. Большинство клеток млекопитающих не выращиваются при температуре инкубирования выше около 40°С. Предпочтительные температуры способа настоящего изобретения колеблются от около 38 до около 39°С, тогда как наиболее предпочтительное осуществление настоящего изобретения включает температуру инкубирования аденовирус-трансформированной клеточной линии при около 39°С. Способ настоящего изобретения позволит более легко отобрать такие клоны, которые экспрессируют высокие уровни протеина С. Например, так как уровень протеина С, секретируемого из клеточной линии, повышен, легче исследовать молекулу в неочищенной среде, следовательно, легче отобрать клон, который экспрессирует самый высокий уровень желаемого продукта. Среднее увеличение в уровнях экспрессии для клонов, выделенных при 39°С, колеблется от около 69 до 93% по сравнению с клонами, выделенными при 37°С. Следующие примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения, но не для его ограничения. П р и м е р 1. Продуцирование человеческого протеина С в клетках 293. Рекомбинантный человеческий протеин С (рЧПС, Recombinant human protein С гНРС) был продуцирован клетками 293 человеческой почки методом, хорошо из вестным специалистам, подобным методу Yan, U.S. Patent № 4981952. Генный закодированный человеческий протеин С описан и заявлен Bang et al., U.S. Patent № 4775624. Плазмида, используемая для экспрессии человеческого протеина С в клетках 298, была плазмидой pLPC, котофая описана Bang et al., U.S. Patent № 4992373. Строение плазмиды pLPC описано также в Европейской патентной публикации № 0445939 и Gnnnell et at., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192. Коротко говоря, плазмида pLPC была трансфецирована в клетки 293, затем стабильные 26870 трансформанты идентифицируют и субкультивируют. Клоны, демонстрирующие наиболее высокий уровень экспрессии дали различные обозначения (например, СС35 и СС31-1) и выращены при стандартных для клеточной культуры условиях. Альтернативно, плазмида pGTC была использована для создания стабильно-трансформированной клеточной линии GT-21. Строение плазмиды pGTC было описано в Европейской патентной публикации № 445939. После выращивания при 37°С человеческий протеин С может быть отделен от культуральной жидкости методом Yan, U.S. Patent № 4981952. Человеческий протеин С, полученный таким образом, может быть использован в неактивированной зимогенной форме или может быть активирован способами, хорошо известными специалистам. Те же самые клоны могут быть также выращены при тех 5 10 15 20 8 же условиях при 39°С. Результаты представлены в табл. 1. Тогда, когда клетки выращены при различных плотностях клеток, что приводит к получению различных уровней экспрессии для клетки (например, СС35), постоянно наблюдалось увеличение процента секреции при 39°С. П р и м е р 2. Продуцирование человеческого протеина С в клетках AV 12-664. Человеческий протеин С был продуцирован с использованием плазмиды pLPC в соответствии с методиками примера 1, за исключением того, что клетки AV-664 сирийского хомяка были использованы вместо клеток 293 почки эмбриона человека. Функциональная антикоагулянтная активность измерялась способами Grinnetl et al., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192. Результаты представлены в табл. 2. Т а б л и ц а 1 Влияние роста температуры на количество протеина С, секретируемого из клеток 293 Клон, нг/106 День, 37°С, нг/106 День, 39°С Процент увеличения СС35 СС35 GT-21 СС31-1 СС35 СС35 395 425 237 663 664 747 1164 2361 1227 3906 68 56 215 103 49 86 824 2100 Т а б л и ц а 2 Влияние роста температуры на функциональную антикоагулянтную активность человеческого протеина С, продуцированного в клетках AV12 Температура, °С Единицы, мг 37 39 216±62 460±19 Упорядник Техред М. Келемеш Коректор Замовлення 537 Тираж Підписне М. Куль Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Киів-53, Львівська пл м 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101