Спосіб підвищення інфекційної активності вірусної сировини для виробництва біологічних препаратів

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, вирусологии, биотехнологии и может быть использовано при изготовлении противовирусных препаратов. Известны способы концентрации растворов макромолекул при помощи диализа против полиэтиленгликоля или карбовакса [1]. Этот метод основан на способности сухого полиэтиленгликоля впитывать в большом количестве воду и соли. Недостатком этого метода является продолжительность и сложность процедуры, что отрицательно сказывается при концентрировании лабильных вирусов. В последнее время обнаружена еще одна способность полиэтиленгликоля с мол.весом 6000 - осаждать некоторые вирусы из вируссодержащей суспензии. Этот метод быстрее первого. К вирусной суспензии, содержащей 0,14М добавляют карбовакс 6000 до концентрации 7,5%, pH смеси 7,4. Смесь перемешивают и оставляют на один час при Преципитат осаждают при в течение 400мин. Осадок ресуспендируют в физиологическом забуференном растворе 1/100 объема от исходного материала. При этой процедуре большое значение имеет pH смеси. Она должна быть близкой к 7,0 при физиологически нормальном солевом составе среды. Более высокое содержание снижает эффективность концентрации полиэтиленгликолем. Все эти нюансы усложняют процесс концентрации вирусов и повышения их инфекционной активности. В качестве прототипа выбран пример выращивания вируса герпеса обыкновенного в клетках и ДК с высоким титром в культуре клеточной ткани Ройзмана и Спира [2]. Для этого клетки выращивали в цилиндрических сосуда х с вращающейся мешалкой. Для быстрого роста клетки диспергировали в количестве 108 в 200мл среды, содержащей 10% сыворотки теленка, раствор Эрла и среду Игла с двойным количеством витаминов и аминокислот. Клетки перемешивали в течение 3 - 4 дней со скоростью 0,3 - 0,5об/мин при Титр клеток возрастал до 5- 7 ´108. Параллельно монослой клеток, содержащий 4 ´ 107 клеток на 900мл среды, инкубировали с вирусом при в течение 18ч. После этого зараженные клетки суспендировали в 100мл среды (1% сыворотки теленка в среде 199 и забуференной до pH 7,0). Среду для выращивания клеток в больших сосудах заменяли суспензией зараженных клеток и культуру перемешивали при Через 20 - 24ч инкубации клетки смывали со стекла и собирали центрифугированием. После разрушения зараженных клеток в пяти объемах дистиллированной воды с последующей обработкой в гомогенизаторе Дауэнса титр полученного вируса составлял 5 - 8 ´ 1010БОЕ на 10мл культуральной жидкости. Процесс получения сложен и длителен по времени. Задачей изобретения является изыскание способов и подбор препаратов со способностью увеличивать инфекционную активность на основе естественного сырья, упрощение технологического процесса, сокращения затрат времени. Поставленная задача достигается использованием для повышения вирусной активности ин витро настойки женьшеня в концентрациях 0,03 - 0,05см 3. Женьшень характеризуется как растение концентратор биологически активных веществ, извлекаемых водой и другими растворителями и экстрагирующая способность увеличивается от чистого спирта к водно-спиртовым смесям низкой концентрации, достигая максимума при использовании в качестве растворителя воды, при условии извлечения экстрактивных биологически активных веществ на холоду. Настойка женьшеня при обработке вирусного сырья определенным способом может выступать в качестве средства, повышающего инфекционную активность вирусов в перевиваемых культурах клеток свиного происхождения: СПЭВ (свиной почки эмбриональная версенная линия). Критерием, увеличивающим активность действия вирусов, служит повышение титров их инфекционности в присутствии различных малых концентраций настойки женьшеня в сравнении с контрольными титрами вирусов, обработанных в тех же концентрациях изотоническим раствором натрия хлористого. Эффект женьшеня на организм в значительной степени зависит от дозы, которая используется. Для изучения повышающего инфекционную активность вирусов действия настойки женьшеня проведены исследования в эксперименте ин витро на перевиваемой культуре клеток свиного происхождения - СПЭВ в отношении РНКсодержащего вируса-коронавируса животных. Моделью служил вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС). Антиген используется при производстве живых вакцин против вирусного гастроэнтерита свиней. Вирус адаптирован к системе перевиваемой культуры клеток свиного происхождения - СПЭВ. Изобретение осуществляется следующим образом. Женьшень получают культивированием на твердой среде калусной культуры корня женьшеня. Полученную массу снимают с поверхности среды и лиофилизируют с последующим использованием ее для приготовления настойки. Для получения экстракта женьшеня навеску его корня весом 15,0г измельчают, заливают 0,85% изотоническим стерильным раствором натрия хлористого, экстрагируют в течение 72ч в холодильнике при температуре +4°C, а затем стерилизуют путем нагревания на водяной бане при температуре 75 ± 2°C в течение 60мин. Используемые перевиваемые культуры клеток свиного происхождения выращивают в ростовой среде, содержащей смесь сред - 199 (30%) и пятипроцентного гемогидролизата лактальбумина (60%) с добавлением инактивированной (при 56°C в течение 60мин) сыворотки крупного рогатого скота (10%) и раствора бикарбоната натрия для установления pH 7,2 - 7,4, а также антибиотиков бензилпенициллин натриевой соли - 100Ед/см 3, стрептомицина сульфата 100мг/см 3. Для получения клеточной суспензии монослой культуры клеток снимают с культуральной посуды растворами: 0,3% раствором трипсина и 0,02% раствора версема (1 : 1). Полученную суспензию клеток разводят ростовой средой до конечной концентрации 200.000 клеток/см 3 и выращивают в пробирках либо во флакончиках. Для подсчета количества клеток к 0,2мл суспензии добавляют 0,8мл 0,5% - ного водного раствора трипанового синего и тщательно перемешивают. Через 5мин окрашенной взвесью клеток заполняют счетную камеру Горяева. Трипановый синий окрашивает только мертвые клетки. Подсчет ведут только неокрашенных клеток при малом увеличении микроскопа (окуляр 7, объектив 20) в двух и более сетках по всей их площади. Число клеток в 1мл суспензии определяют по формуле: где - число клеток в 1мл суспензии; - среднее число клеток в одной сетке; - кратность разведения концентрированной клеточной суспензии; 1000 - число кубических миллиметров в 1см 3; 0,9 - объем сетки Горяева в кубических миллиметрах. Пробирки с клетками помещают в лотки под углом 5° (пробками вверх). Лотки с матрасами и пробирками помещают в горизонтальном положении. Культивирование клеток производят при +37°C в стационарных усло виях. Через сутки после посева клеток в целях поддержания дальнейшего роста клеток производят смену ростовой среды и культивируют далее при тех же условиях до сформирования полного клеточного монослоя. Подготовка вирусного сырья для исследований производится следующим образом: готовят расплодку вируса в той же культуре клеток, в какой проводят исследования. Для этого из флаконов со сформированным монослоем клеток сливают ростовую среду и инфицируют культур у клеток вируссодержащей жидкостью, равномерно распределяя ее по клеточному монослою. Затем оставляют для адсорбции на 1ч при комнатной температуре, после чего вируссодержащий материал сливают, а к клеточному монослою прибавляют поддерживающую среду и инкубируют при +37°C до проявления цитопатического действия вируса (ЦПД). При поражении клеточного монослоя вирусом на 50 - 75% флаконы с инфицированным монослоем подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию для дезинтеграции клеток и полному выходу вируса в поддерживающую среду. После этого проводят центрифугирование при 5000об/30мин для полного осаждения разрушенных частей клеток. Надосадочную жидкость отбирают в стерильных условиях, определяют титр вируса любым из известных методов титрования, расфасовывают по флакончикам приблизительно в количестве 5мл и замораживают для проведения исследований. Используемые вирусы: 1. Референтный штамм вируса ТГС "Пурдью115", адаптирован к культуре клеток СПЭВ на уровне 45 пассажа. Проведение всех работ происходило в условиях строжайшей асептики. Монослой культуры клеток выращивали в витаминных плоских флакончиках, емкостью 50см 3. Для сформирования монослоя во флаконы заливают по 7мл клеточной суспензии с количеством клеток 200 000 в одном миллилитре. Флаконы помещали одной большой плоской стороной на ровную горизонтальную поверхность и инкубировали в термостатах при +37°C. Формование монослоя контролировали ежедневно под световым микроскопом. Клеточный монослой формировался полностью обычно на вторые сутки после посева и был пригоден для выполнения вирусологических работ. Готовую настойку женьшеня прибавляли к суспензии культурального вируса в концентрациях от 0,01см 3 - 0,09см 3, хорошо встряхивали, после чего сразу наносили, равномерно распределяя эту смесь на отмытый раствором Хенкса сформированный монослой клеток для адсорбции. Адсорбция длилась 1ч в темноте при комнатной температуре (опытные образцы). После этого инфицированную культуру клетокпокрывали поддерживающей средой гемогидролиза-том 5% с pH 6,5 - 7,0 и культивировали дальше в термостате при +37°C параллельно с интактными контролями и контролем, в монослой которого вносили то же количество настойки женьшеня для контакта на то же время, что и опытные образцы, после чего добавляли ту же поддерживающую среду. Результаты учи тывали под световым микроскопом, начиная с 12 часов после инфицирования. По степени и характеру развития цитопатического действия вируса на монослой клеток, оценивали в процентном отношении повреждение культуры клеток, а также время развития цитопатического действия вируса, как это обычно производится при всех вирусологических исследованиях. Характер ЦПД при воздействии изучаемых разных концентраций настойки женьшеня на вирус не изменился и скорость развития повреждения монослоя клеток вируса не зависела от времени проявления. Оказалось, что имелись изменения инфекционной активности вирусов, обработанных указанными концентрациями настойки женьшеня по сравнению с соответствующим вирусом, не обработанным этой настойкой (контроль). Настойка женьшеня в указанном интервале способствовала повышению вирусной активности, что показано на графике/ Пример. В экспериментах с вирусом ТГС при определении его инфекционной активности без и с обработкой настойкой женьшеня применяли титрование методом предельных разведений. При этом все параметры опыта выдерживались одинаково в контроле и в опыте за исключением концентраций настойки женьшеня, Культура клеток одна и та же, к которой вирус ТГС адаптирован СПЭВ. Был определен интервал значений, в которых проведение исследований с поставленной целью было возможным. Им оказалась обработка вирусной суспензии настойкой женьшеня в концентрациях 0,03 - 0,005см 3 включительно. При концентрациях ниже 0,03см 3 и выше 0,05см 3 указанного эффекта не наблюдали. Титр контрольного вируса "Пурдью-115" 45 - го пассажа в культуре клеток СПЭВ составил женьшеня сравнению При воздействии настойки концентрации 0,03см 3 он стал в с что выше чем на контролем. Разница по между инфекционной активностью достоверна Таким образом, при осуществлении изобретения, настойка женьшеня повышает инфекционную активность вируса ТГС при культивировании ин витро в культуре клеток безопасна в обращении за счет применения естественного сырья приводит к сокращению времени (4 дня по сравнению с прототипом - 7 - 8 дней) и упрощению технологического процесса, не требующего дополнительной его обработки.