Застосування визначення якісного стану колагену як способу діагностики функціонального стану шкіри людини

Застосування визначення якісного стану колагену як способу діагностики функціонального стану шкіри людини. (19) (21) a200706295 (22) 07.06.2007 (24) 25.12.2007 (72) ВЕРЕЩАКА ВОЛОДИМИР ВАЛЕНТИНОВИЧ, UA 3 водою до чистих промивних вод. Матеріал вносили у 0,1 Μ розчин оцтової кислоти (300мл на 1г матеріалу) і залишали при постійному перемішуванні на 48 годин при температурі 4°С. Розчин фільтрували через скляний фільтр і розводили у 20 разів бідистильованою водою. Залишки оцтової кислоти видаляли за допомогою роторного випарювача протягом 48 годин. Висушування проводили у чашках Петрі при температурі 37°С до постійної маси. Зв'язування кислот і лугів колагеновою біоматрицею визначали шляхом її обробки різними об'ємами 0,13 N розчинами НСІ та NaOH з наступним вимірюванням рН. Вивчення скорочення колагенових волокон під дією 0,13 N НСІ проводилося на нативних біоптатах і фіксованих у 10% розчині NaCl протягом 24 годин. За допомогою кріомікротому вирізали лоскути, виділяли колагенові волокна, наносили на предметні скельця, вимірювали за допомогую об'єкт-мікрометра довжину колагенових волокон, які знаходяться у полі зору мікроскопа. На препарат наносили 0,13 N розчин НСІ, покривали його покривним скельцем і інкубували 2хв при кімнатній температурі. Наступним етапом дослідження було визначення середнього відсотка скорочення волокна. Гістологічні зміни, які виявлялися на парних зрізах фіксованих у 10%-му розчині нейтрального формальдегіду і 10% розчині NaCl були ідентичними. В осіб І групи роговий шар складається з 4-5 рядів рогових лусочок, цитоплазма яких повністю заповнена кератином. Кератиноцити щільно з'єднані між собою і не мають виразних міжклітинних просторів. Ядра в клітинах рогового шару не ідентифікуються. Між кератиноцитами остистого та зернистого шарів виявляються міжклітинні простори. Базальні епідермоцити циліндричної форми, мають дещо видовжене ядро. Артеріоли та посткапілярні венули спостерігаються поза межами дермальних сосочків. У дермі виявляється значна кількість фібробластів. У сосочковому шарі дерми колагенові волокна тонковолокнисті, мають щільне розташування. В межі з сітчастим шаром виявляється їх розрихлення та помірне збільшення. У сосочковому шарі, особливо у нижній частині, колагенові волокна широкі та щільні. Еластичні волокна помірно виражені, структуровані, звивисті, розташовані між колагеновими фібрилами. Виялений міцний зв'язок між епітеліальними і сполучнотканинними утвореннями. Особливості морфології шкіри обличчя не мали статевих відмінностей, що збігається з літературними даними [1-2статьи єлектронки]. У обстежених осіб II - IV дослідних груп епідерміс витончений. Загальне витончення епідермісу супроводжується потовщенням рогового шару, зменшенням товщини остистого. Проміжки між роговими лусочками дещо розширені. Ці зміни більш виражені у осіб III групи. В епідермоцитах шилоподібного та зернистого шарів виявляється порушення процесів кератинізації. Міжклітинні проміжки в базальному 28644 4 та шиповатому шарі розширені. Кератинові гранули виявлялися у вигляді глибок, нерівномірно розподілених у цитоплазмі. В клітинах базального шару епідермісу ядра набувають неправильних контурів. Просвіти капілярів сосочкового шару дерми звужені. У дермі зменшується кількість клітин фібробластичного ряду. В сітчатому шарі дерми сітка колагенових пучків розрихлюється. Колагенові волокна дерми розташовувані рихло порівняно з такими у контрольній групі. Колагенові волокна розділені локусами аморфної речовини, фрагментовані та слабо контуровані. В осіб III групи спостерігалася значна кількість незрілих колагенових волокон, які зливалися у глибки аморфної речовини. В еластичних волокнах дерми виявляються ділянки потовщення та дезорганізації фібрил, локусів лізису, гомогенізації та фрагментації, що свідчить про дистрофічні зміни. Деякі ділянки еластичних волокон перетворюються в безструктурні гомогенізовані маси. У сітчастому шарі дерми, особливо на межі з підшкірною основою, виявляється виражена дилатація венул. Має місце діапедез еритроцитів, а інколи мікрокрововиливи. Кількість волосяних фолікулів і сальних залоз зменшена. Виявлені зміни були більш вираженими у привушножувальної області. У зразках фіксованих 10% розчином NaCl виявляється помірне ущільнення структури колагенових волокон, зменшення ядерно-цитоплазматичного індекса Гертвіга у базальних епідермоцитах, зменшення товщини дерми. Тобто вікові зміни сполучної тканини шкіри у всіх групах ідентичні та характеризуються ознаками фіброзу. У дермі виявлено збільшення кількості колагенових волокон з ознаками їх дегенеративних змін. Фіксація 10% розчином NaCl призводить до зневоднення об'єкта, що сприяє, на нашу думку, зменшенню кількості водневих зв'язків поліпептидів "бахроми" і утворенню пептидних зв'язків між її фібрилами. Для визначення механізму дії лугів на колагенове волокно проводили обробку нативного колагену 0,1 N розчином NaOH. Крива зв'язування 0,1 N розчину NaOH колагеновою біоматрицею представлена на Фіг.1. Встановлено, що крива між рН 4,5 і 10,1 показує спочатку повільне, а потім більш швидке зв'язування лугу (викликається кислотними групами колагену). У межах рН від 10,1 до 12,9 лежить ділянка нового зв'язування лугу, обумовлена, на нашу думку, утворенням єнольної форми зв'язку в поліпептиді. Тобто зв'язування іде не лише за кінцевими ділянками поліпептидів "бахроми", але й за пептидними групами молекулярного скелету колагенового волокна, що не дає можливості дослідити фізикохімічні процеси, які відбуваються на його поверхні. Крива зв'язування 0,1 N розчину НСІ колагеновою біоматрицею представлена на Фіг.2, При вивченні дії соляної кислоти на колаген встановлено, що у межах рН від 2,5 до 4,5 існує залежність між зв'язуванням кислоти і зниженням величини рН виражається практично прямою лінією. При збільшенні об'єму соляної кислоти її поглинання зростає до певного максимуму, після 5 чого практично не змінюється. Тобто збільшення водневої оболонки при набуханні у розчині соляної кислоти пояснює зміну форми волокна з повздовжньої у кулеподібну, що виявляється скороченням лінійних розмірів волокна. Набухання колагену в соляній кислоті представлено на фігурі 3. При вивчені кривої набухання колагену в розчині соляної кислоти (0,2г колагену на 20см3 розчину кислоти) виявлена залежність від її концентрації. Соляна кислота при низькій концентрації (0,02 N) показує максимум набухання, за яким при збільшенні концентрації кислоти йде різке падіння кривої набухання. Як видно з наведеного графіка (Фіг.3), максимум набухання співпадає з максимумом поглинання кислоти. Це означає, що при підвищенні концентрації кислоти набухання і поглинання кислоти збільшується до певного рівня. При подальшому зростанні концентрації кислоти набухання знову зменшується. Експериментально було встановлено, що 0,13 N розчин НСІ є найбільш прийнятним, оскільки при збільшенні концентрації соляної кислоти виникає швидка гомогенізація колагенових волокон з утворенням безструктурної маси, що не дозволяє визначити їх контури. Середній відсоток вкорочення колагенових волокон у препаратах контролю, фіксованих 10% розчином NaCl під дією соляної кислоти у контролі коливався від 25 до 40% і не мав істотних відмінностей в різних анатомічних зонах. У парних нативних препаратах цієї групи відсоток сили контракції мав менші значення і становив 15 - 30%. Відмінності у контракції можна пояснити тим, що консервація сіллю призводить до часткового гідролізу поліпептидів бахроми і зменшення їх резистентності, тобто сольова фіксація призводить до часткової втрати водневих зв'язків, які є стабілізаторами колагенового волокна. При збільшенні експозиції засолювання контракція волокон збільшується. У шкірі осіб дослідних груп, яка піддавалася засолюванню, відсоток вкорочення не мав статевих відмінностей і коливався від 40 до 60% у пупкової області та 44 - 70% у привушножувальній. На нашу думку, при дії кислоти виникають явища інертної дегідратації, що призводить до руйнуваня водневих зв'язків між колагеновими фібрилами і розщеплення поліпептидного ланцюга на мікрофібрили з одночасним спіралеподібним зкручуванням. Таким чином, колагенові волокна осіб похилого віку мають меншу сталість до дії кислот, що виявляється більшим відсоток скорочення. Отримані дані дозволили встановити залежність між показниками гістоструктури колагенового волокна і цифрових показників контракції. Процес контракції колагенового волокна у кислотному середовищі слід пояснювати, виходячи з положення, що колаген є кислоторозчинним гідрофільним поліелектролітом. У звичайному стані, зокрема у водному розчині, існує максимально невимушена рівновага у розгалуженні полімерних ланцюгів. Має місце 28644 6 максимальне віддалення бокових відгалужень, а також сусідніх макроланцюгів. Є необхідним також врахування факту існування "бахроми", яка теж є стабілізатором макроструктури колагенових ланцюгів, глобул, спіралей та інших агрегацій. Доречно зауважити, що бокові відгалуження, які формують "бахрому", мають збільшену реакційну здатність у порівнянні з основними макроланцюговими спіралеподібними утвореннями. Під впливом НСІ виникає кислотний гідроліз поліпептидних зв'язків і у першу чергу в бахромчастій частині макромолекул. У результаті цього відбувається руйнування бахроми, яка виступає стабілізатором, буфером, між основними макроланцюгами. Макроланцюги, позбавлені своїх стабілізаторів, набувають певної механічної рухливості. Оскільки колагенові волокна є жорсткими каркасними утвореннями, вони мають певне механічне напруження, яке є основним структуруючим чинником фібрилярної системи колагенового каркасу. Відсутність стабілізаційного впливу бахроми призводить до рухомості макроланцюгів, вони набувають можливості наближатися щільніше один до одного, що відбивається у загальній контракції (скороченні) колагенових волокон. Слід зауважити, що контракція під впливом НСІ не є безкінечною. Пояснюється це тим, що використана концентрація кислоти обмежує гідролітичну здатність розчину. Концентрація НСІ є достатньою для гідролізу поверхневої бахромчастої структури. При цьому жорсткі основні макроланцюги не підпадають під процес гідролізу достатньо слабкої соляної кислоти. Для колагену, що визначає морфологічну структуру дерми, реакція на соляну кислоту виражається у вираженому ущільненні зразка. Причина ущільнення - розрив поперечних зв'язків, що призводить до контракції структурних елементів волокна. Фізико-хімічні параметри колагену змінюються з віком. Метод кислотного набухання дозволяє виявити вікові зміни у фізико-хімічному стані колагенового волокна шкіри, які практично неможливо визначити у зафарбованих гістологічних препаратах, а також виявити ступень його ураження. Кислотне набухання колагену дає можливість об'єктивізувати функціональні зміни, що є особливо важливим у дослідженні патогенезу старечої в'ялості шкіри і, зокрема, зморшок. Джерела інформації 1. Вольперт Г.Р. Определение качественного состояния коллагена в мокро-соленом сырье.Легкая промышленность.- 1948.- №8.- С.14-15. 2. Микроскопическая техника: Руководство/Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова.- М.: Медицина, 1996.- 544с. 7 28644 8