Спосіб адоптивної імунотерапії злоякісних новоутворень

1. Спосіб адоптивної імунотерапії злоякісних новоутворень, включаючий стимулювання проліферації імунних кліток шляхом інкубування кліток відібраної порції крові пацієнта з бласттрансфор 28843 то є ймовірність інфекціювання хворого з тяжкими наслідками. Відомий також спосіб протипухлинної терапії при первинному раці печінки, включаючий введення інтерлейкіну-2 та адріміціну [3], при якому за добу до введення інтерлейкіну-2 проводять гемосорбцію з послідуючим введенням донорської плазми, обробленої активованим вуглем, а через день після закінчення терапії інтерлейкіном-2 одноразово усерединоартеріально вводять адріаміцін, розчинений у ліпіодолі. Внаслідку проведення курсу імунотерапії відзначено суттєве покращення біохімічних показників, та зареєстровано інбігування роста пухлини, та її зменьшення (за даними УЗД та комп'ютерної томографії), запобігнено метастазування. Отже, використання за цим способом гемосорбції всеж таки іноді веде до метастазування пухлини, тобто до вимиття антитіл та нейлонів, а введення донорської плазми може привести до анфілактичного шоку. Вживання за даним способом адріаміціну з інтерлейкіном-2, у пропонуємих авторами цього способу дозах, може привести до адріаміцінової кардіоміопатії та інфаркту міокарда, а вживання самого інтерлейкіну-2 веде до некрозів здорових тканин і передчасної загибелі пацієнта. Відомо також вживання активованих інтерлейкіном-2 лімфоцитів та інтерлейкіну-2 для лікування хворих з метастазованим раком, а також TLлімфоцитів, культивованих також інтерлейкіном-2. При цьому вузол пухлинної тканини розміром з невеличку сливу вилучають хірургійним шляхом, відділяють з неї приблизно 50 млн клітин, потім культивують з інтерлейкіном-2 до тих пір поки пухлинні клітини не загинуть та не заміщатимуться безліч розділяючихся TL-лімфоцитів. Приблизно 200 млрд цих клітин вводять пацієнтові разом з інтерлейкіном-2. В наслідку лікування здобуті добрі результати в 55% випадків. Це в двічі більш, ніж при лікуванні за допомогою активованих інтерлейкіном-2 лімфоцитів [4]. Отже, описані вище способи виявляються складними, коштовними та травматичними, а використання при цьому інтерлейкіну-2 стикається з побічними ефектами. Найбільш близьким за призначенням, технічної суті та досягаємому наслідку при використанні є спосіб, включаючий відбір 200-300 мл крові онкологічного хворого, змішування її з 10-5000 ME гепаріну, її сепарацію та виділення лімфобластів NK-клітин, які інкубують під час 3 діб у термостаті у ростовому поживному середовищі 199 у присутні інтерлейкіну-2, а потім одержану клітинну суспензію усереденівено вертають онкологічному хворому [5]. Описаний вище спосіб має ряд безсуперечних переваг перед відомими способами хіміо- та променевої терапії. Пропонуємий спосіб аутологічний та не викпикає алергічних реакцій, не пригноблює імунітет, високо ефективен проти таких видів пухлин, як меланобластома та міосаркома. Отже, відомо, що сильна та різка стимуляція імунітету інтерлейкіном-2 дуже часто доводить до швидкого виснаження імунітету та імуносупресії, що інколи доводить до протилежного наслідку при лікуванні злоякісних новоутворень. Другою вадою даного способу, за думкою авторів, являється ви сока коштовність лікування, необхідність використання численої кількості коштовних препаратів та центріфуг для лімфоцитів, спеціально обладнаних приміщень, а також вельми коштовного та відносно токсичного імтерлейкіну-2, що перешкоджає вживанню даного способу для масового лікування. Тому ціллю пропонуємого рішення є спрощення способу лікування, виключення складних коштовних операцій та препаратів, зменшення побічних негативних ефектів. В основу винаходу поставлена задача удосконалення способу адоптивної імунотерапії злоякісних новоутворень, у якому, внаслідок використання у якості бласттрансформуючого агента лектіну ML-1 для інкубації порції цільної крові, яку після інкубації ділять на дози, та періодичного введення їх під час одного курсу, при цьому курси лікування повторюють не менш двох разів, забезпечується стимуляція вироблювання Т-хелперами інтерлейкінів-1,2,6,7, і врахунок цього стимулюється бласттрансформація лімфоцитів та вироблення фактора некрозу пухлини (ФНП) макрофагами. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі адоптивної імунотерапії злоякісних новоутворень, включаючем стимулювання проліферації імунних клітин шляхом інкубування клітин відібраної порції крові пацієнта є бласттрансформуючим агентом, відповідно звиходом, у якості бласттрансформуючого агента використовують лектін ML-1, при цьому після інкубації цільної крові її ділять на дози, які періодично вводять пацієнтові під час одного курсу лікування, при цьому курс лікування повторюють не менш двох разів. Лектін ML-1 використовують для інкубації цільної крові пацієнта у дозі 1-15 мкг/мг ваги пацієнта. Цей інтервал обумовлен тим, що при значеннях менш 1 мкг/кг ваги пацієнта нема стимуляції вироблювання Т-хелперами інтерлейкінів, а при значеннях більших за 15 мкг/кг ваги пацієнта, помітно наростання токсичних ефектів. Інкубування цільної крові пацієнта проводять тривалістю не менш 23-25 годин тому, що через добу інкубації, як правило, трансформується 2025% лімфоцитів, і у кожній послідуючій порції крові кількість бласттрансформованих лімфоцитів та тітр ФНО більше на 20-30%, ніж у попередній, за рахунок тривалості інкубації. Курси лікування повторюють з інтервалом 17 діб. Відомо, що сильна та різка стимуляція імунітету інтерлейкіном-2 часто доводить до швидкого виснаження імунітету та імуносупресії, до наростання токсичних ефектів, що іноді доводить до протилежного наслідку при лікуванні інтерлейкіном-2 - до прогресії пухлини. Для запобігання цього побічного ефекту інтерлейкінотерапії пропонують вводити стимульовану кров під час курсу лікування періодично з інтервалом не менш доби та не більш 7 діб. Як правило, через 7 діб усі токсичні ефекти зникають, і організм готов до продовження лікування. Періодичне введення окремих доз інкубованої цільної крові також сприяє зниженню токсичних ефектів та рівномірному розподілу бласттрансформованих лімфоцитів у організмі. Повторення курсу лікування необхідно для виробки тривалого фактору некрозу пухлини (ФНП) макрофагами. 2 28843 Як видно із викладення суті запропонованого рішення, пропонуємий спосіб у порівнянні з відомим являється більш підсильним, тому що не включає використання коштовного препарату, яким являється інтерлейкін-2, одержуємий способом генної інеженерії. Коштовність лікування знижується у 3-4 рази. До того ж, спосіб виключає появу побічних небажаних ефектів, пов'язаних з токсичністю інтерлейкіну-2 та можливістю виснаження імунітету. Як видно з викладення суті запропонованого способу, він відрізняється від прототипу і, внаслідок, являється новим. Рішення має також винахідницький рівень. Відома наявність у лектинів ряда характерних імунологічних реакцій таким, як аглютинація, преціпітація. Деякі лектіни викликають виборчу аглютинацію злоякісних пухлинних клітин, що свідчить про неоднаковість у структурі поверхні останніх та нормальних клітин [6]. Отже, специфічність пов'язання лектину з клітинами обумовленого типу носить стертий характер, оскільки різноманітність глікопротеінів велика, а набір вуглеводів, які входять до їх складу, вельми обмежений. Найбільш широко відомі два мітогених лектина, які використовують при вивчені активації лімфоцитів - фітогемаглютинін (ФГА), пов'язуючий алігоцукериди, та конканавалін (Кон А), пов'язуючи цукеріди - та з деякою ефективністю взаємодіючий з усіма клітинами периферійної крові людини. Мітогені властивості інших лектинів вивчені мало, а декотрі взагалі не являються мітогенами [7]. Дослідження авторами лектину омели білої ML-1 показали, що він стимулює вироблення Тхелперами інтерлейкінів-1,2,6,7, які у даному випадку не являються екзогенними, що зменшує ризик побічних небажаних ефектів. Лектин ML-1 являється також сильним мітогеном, він стимулює бласттрансформацію лімфоцитів та виробку фактору некрозу пухлини (ФНП) макрофагами. Ці властивості лектину ML-1 являються новими та раніше не відомими. Використання пропонуємих параметрів здійснення способу дозволяє досягнути його найбільшої ефективності та звести до мінімуму небажані побічні ефекти. Пропонуємий спосіб адоптивної імунотерапії злоякісних новоутворень може знайти застосування у практичній медицині. Приклади застосування способу Приклад 1. 15 білих безпорідних мишей обоїх статей утримали на раціоні віварію. Діагноз: інокулювання у брюшну порожнечу по 5 млн. асцитних клітин аденокарціноми Ерліха. Через 6 діб маса тварин збільшилась у 1,5 та більш разів. Призначення: 8 тваринам курс адоптивної імунотерапії з використанням по 1 мл крові для щоденного введення струйно усередновено у хвостову вену кожній тварині. Препарат для ін'єкцій готували слідуючим чином. 0,2 мл крові стимулювали доданням 0,02% розчину ML-1, 0,2 мл альбуміну та 0,2 мл середовища 199, інкубували добу, відмивали від середовища 199. У наслідку у 6 мишей вага нормалізувалась повністю, із них через місяць 3 миші загинули при відсутності дегенерації органів та признаків пухлини. У залишившихся 2 мишей вага зменшилася на 50%, та прожили вони довше контрольних. 7 тварин залишили для контролю. Їм вводили аутологічну кров без ML-1. У контролі вага тварин продовжувала підвищуватися, во Як видно із таблиці, у лікованих запропонованим засобом тварин практично нормалізувалася вага (22 г середній проти 32 г у контролі), а виживаємість наблизилась до терміну життя здорових тварин (середня виживаємість тварин основного експерименту 51,4 дня проти 13,3 у контролі). Таким чином, можна стверджувати, що спосіб ефективний у 80% випадків на моделі асцитноі аденокарціноми Ерліха. При гістологічному вивченні тканинних зрізів тільки у 2 мишей були ознаки дісплазії печінки. За літературними даними активність стимульованих інтерлейкіном аутологічних лімфоцитів у способі-прототипі наближається до 35-40%. Приклад 2. Хвора А. 53 років. Діагноз: рак груді-аденокарцінома, пухлина розміром 7´15 см, регіонарні лімфовузли збільшені, метастази у легенях. Призначення: з інтервалом у дві неділі два курси лікування адоптівною імунотерапією з використанням по 300 мл крові пацієнта підготовленої та розділеної на 4 усередновених краплинних ін'єкцій з інтервалом 23-24 години. Препарат для ін'єкцій готують слідуючим шляхом. Лектин омели білої ML-1 по 4-7 мкг/кг ваги пацієнта вводять у стерильні флакони, які містять по 150 мл крові пацієнта, 50 мл середовища 199 та 55 мл людяного альбуміну. Інкубували добу, відмили від середовища 199. У наслідку відмічена повна регресія пухлини, оскільки візуально, ні при пальпації, ні при обстежені на УЗД пухлина не відзначається. Флюорографічне дослідження легенів показує відсутність метастазів. Загальне становище пацієнтки задовільне. Таким чином, експериментальна перевірка підтвердила, що пропонуємий спосіб дозволяє досягнути максимального протипухлинного ефекту терапії у середньому 60-80% регресії пухлини у порівнянні з 10-15% у прототипі. При цьому пропонуємий спосіб не потребує значних витрат на обладнання та препарати для лікування. Джерела інформації 2. Описание к патенту РФ № 2026689, М. кл. А61К45/05, от 04.06.1991. 3. Описание к патенту РФ № 2026679, М. кл. А61К35/14, от 30.01.1993. 4. Розенберг С.А. Адоптивная иммунотерапия рака. - В мире науки. - Scientific American (издание на русском языке), № 7, июль 1990 г. 5. Rosenberg S.A. The development of new immunotherapies for the treatment ofcancer using interleukin-2. - Annals of surgery. Vol. 208, № 2, p. 121135, Aug., 1988 (прототип). 6. Химическая энциклопедия. Т. 2. - М.: Сов. энциклопедия. - С. 585. 7. Иммунология: В 3-х т. / Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1987-1988. - С. 420-427. 3 28843 Таблиця Номер миші Лектин ML-1 (наявність) 1 2 3 4 5 6 7 + + + + + + + Сроки загибелі після перещеплювання пухлини (доба) 63 52 60 57 67 37 36 8 9 10 11 12 13 14 15 + 39 12 13 12 12 15 17 12 Маса тіла* після лікування (грами) 17+/-2 17+/-1 21+/-2 21+/-2 18+/-1 27+/-0,5 25+/-0,5 26+/-2 29+/-3 31+/-1 36+/-1 32+/-1 35+/-2 31+/-1 30+/-2 * брали середню масу миші із 5 вимірювань за день. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4