Спосіб виявлення патологічного пріону prpsc імуногістохімічним методом

Спосіб виявлення патологічного пріону PrPSc імуногістохімічним методом, що полягає у відновленні патологічного пріон-протеїну за допомогою комбінованого ферментативно-термічного регла 3 33945 ня яких суттєво зменшує ймовірність неспецифічного зв'язування антитіл; - перед нанесенням первинних антитіл на зразки ці антитіла in vitro з'єднують з біотинилюючим реагентом - модифікованим біотинильованими анти-мишачими імуноглобулінами, в результаті чого первинні антитіла зв'язуються з біотинильованими вторинними антитілами. Потім в розчин вносять блокуючий реагент, що містить нормальну мишачу сироватку. Ім уноглобуліни останньої зв'язуються з залишком біотинильованого реагенту, що не зв'язався з первинними антитілами. При цьому мінімізується можлива взаємодія біотинильованого реагенту з ендогенним протеїном досліджуваного зразка, що виключає можливість виникнення неспецифічної реакції; - виготовлений комплекс "первинне антитіло вторинне біотинильоване антитіло" наносять на зразки тканини. Зразки інкубують із стрептавідинпероксидазою. Фарбування завершується внесенням хромоген-субстрату-діамінобензидину (ДАБ). 2. Спосіб виявлення патологічного пріону PrPSc імуногістохімічним методом здійснюється наступним шляхом: Довгастий мозок фіксують у 10% сольовому розчині формаліну, об'єм якого повинен у 10 разів перевищувати об'єм матеріалу. Фіксація мозку триває 14 діб, фіксуючу рідину змінюють через тиждень. Із зафіксованого матеріалу в ділянці затулки (obex) вирізають тотальний шматочок мозкової тканини завтовшки 2-5мм, вміщують у пластикову касету з кришкою та маркують, зазначаючи номер робочого протоколу, дату надходження зразка. Після цього матеріал у касетах дофіксовують у 10% сольовому розчині формаліну протягом доби, а потім витримують у 98% мурашиній кислоті протягом 1 години. Рештки мозкової тканини упаковують, маркують (зазначивши номер робочого протоколу, дату надходження зразка) і зберігають у 10% розчині формаліну до отримання результатів досліджень. Гістологічну обробку проб мозку (видалення фіксатора, знежирення, зневоднення та просочування парафіном) проводять в автоматі для гістологічної обробки тканин карусельного типу STP 120 (Microm, Німечина). При цьому зразки послідовно витримуються у проточній воді протягом 60хв, спиртах: 70% - 90хв, 80% - 90хв, 90% - 90хв, трьох порціях 96% - по 60хв., двох порціях 98% органічного розчиниика (Clear - Rite 3 - суміш ізомерів аліфатичних вуглеводів, що створений спеціально для обробки та фарбування тканин, кат. №6901, Microm, Німеччина) - по 90хв, та дво х порціях гістологічного парафіну (Signature Series суміш полімерів і високоочищеного парафіну, кат. №8338, Microm, Німечина) - по 120хв при температурі +62°С (±1°С). Тривалість гістологічної обробки зразків мозку складає 18год. 30хв. Формування парафінових блоків здійснюють за допомогою станції заливання в парафін АР280 (Microm, Німеччина), використовуючи спеціальні металеві форми та марковані пластикові касети, в яких знаходився матеріал. Шматочки за допомогою пінцету переносять у металеві форми, орієнтуючи у потрібному напрямку, накривають марко 4 ваною пластиковою касетою і заливають парафіном. Форму переносять на охолоджуючу площадку станції заливання в парафін, залишають на кілька хвилин до повного застигання парафіну. Сформований парафіновий блок виймають за допомогою скальпеля. Зрізи завтовшки 5μм виготовляють за допомогою ротаційного мікротома HMS 340E та системи переносу зрізів (Microm, Німеччина). Отримані зрізи розправляються на поверхні води (температура +45°С), потім їх переносять на адгезивне предметне скло (X-tra Adhesive, Surgipath, USA). Виготовлені зрізи підсихають при кімнатній температурі протягом доби. Безпосередньо перед фарбуванням проводять депарафінізацію зрізів, витримуючи їх послідовно у двох порціях органічного розчиннику (Clear - Rite 3, кат. №6901, Microm, Німеччина) по 5хв та дво х порціях 96% етилового спирту - по 5хв з наступним промиванням у двох порціях проточної води (по 5хв). З кожного дослідного зразка нарізають два зрізи. Для контролю правильності проведення пробопідготовки (видалення фіксатора, знежирення, зневоднення, просочування парафіном) та якості реактивів використовують позитивний контроль зріз із референтного (позитивного щодо ГЕ ВРХ) матеріалу. Цей контрольний зріз разом з одним дослідним зразком обробляють моноклональним анти-пріон-протеїновим антитілом SAF 84 (SPI bio кат. №0101, Франція). Для виявлення ступеню неспецифічного фарбування використовують негативний контроль зріз із референтного (негативного щодо ГЕ ВРХ) матеріалу.Цей негативний контроль та другий дослідний зріз обробляють реактивними моноклональними мишачими Ат, синтезованими у тканинній культурі, підкласу IgG2b (Dako Cytomation №X0944). Усі зрізи обробляють 98% мурашиною кислотою протягом 5-7 хвилин, промивають у проточній воді протягом 5 хвилин, а потім двійчі у дистильованій воді по 5 хвилин. Для імуногістохімічного фарбування використовують набір для тваринних тканин К 3954, Dako. Імуногістохімічне фарбування виконують у такій послідовності. Скельця вміщують в скляну посудину, заливають 1М фосфатним буфером рН 7,4 (DAKO PBS - код S 3024) таким чином, щоб скельця були занурені у буфер, і автоклавують у стерилізаторі паровому Sterident (Чехія) при 121°С протягом 20хв. Скельцям дають охолонути до 80°С при кімнатній температурі, а потім промивають у PBS протягом 10хв. Для видалення ендогенної пероксидази зрізи обробляють 3% Н2О2 в метанолі протягом 5-7хв після чого промивають тричі у PBS по 5хв. Щоб уникнути висихання скелець слід користуватися спеціальним касетами Coverplate та штативами для імуногістохімії Shandon (USA). Монтаж скелець у касети Coverplate проводять у PBS, перевіряючи щоб не було пухирців повітря між скельцем і поверхнею касети. Касети зі скельцями розміщують в штатив Shandon. Правильність монтажу скелець перевіряють вно 5 33945 сячи в касету 2мл PBS та спостерігаючи за швидкістю його проходження. Якщо PBS проходить повільно - скельця змонтовані правильно. Усі зрізи обробляють протеїназою К( код S 3020) протягом 10-15хв з розрахунку 150μL на одне скельце та промивають тричі у PBS (по 5хв). На зрізи наносять біотинильований реагент (біотинильоване антитіло) по 100μl на кожен і витримують 15хв. Для приготування біотинильованого антитіла потрібно точно розрахувати і приготувати 5 об'ємів: робочий розчин (об'єм приготованого первинного антитіла, необхідний для фарбування), об'єм концентрованого первинного антитіла, об'єм біотинилюючого реагенту, об'єм блокуючого реагенту та об'єм розчинника. 1. Робочий об'єм готового первинного антитіла визначають для всіх зрізів, які треба зафарбувати. Для цього множать кількість зрізів на об'єм що наноситься на кожен зріз, у μL (n зрізів х μL/зріз=μL робочого об'єму). 2. Щоб визначити об'єм концентрованого первинного антитіла спочатку проводять його титрування у кількох розведеннях і вибирають кінцеве розведення 1/х, яке перевіряють для первинного антитіла. Кількість необхідного концентрованого антитіла в μL обчислюють помноживши робочий об'єм (у μL) на кінцеве розведення первинних антитіл, 1/х (μL робочого об'єму х 1/х кінцевого розведення = μL концентрованого первинного антитіла). Мінімальний об'єм концентрованого первинного Ат повинен бути не менше 1 μL. 3. Об’єм біотинилюючого реагенту (пляшка №2), який необхідно додати до концентрованого первинного антитіла, визначають поділивши концентрацію імуноглобуліну в концетрованому первинному антитілі в μg/mL на 100μg/mL (цей фактор конверсії є стандартним для всіх первинних антитіл і дає оптимальні результати фарбування), а потім помноживши на обчислену кількість необхідного концетрованого первинного антитіла в μL (концентрація імуноглобуліну, μg/mL/100μg/mL) x концентроване первинне антитіло, μL = біотинилюючий реагент, μL. 4. Об'єм блокуючого реагенту (пляшка №3), який необхідно додати до біотинильованого первинного антитіла розраховують розділивши робочий об'єм в μL на 25 (цей фактор розведення є стандартним для робочого об'єму і забезпечує оптимальне зафарбування) (робочий об'єм, μL/25 = об'єм блокуючого реагенту, μL). 5. Щоб визначити об'єм розчинника потрібно від робочого об'єму відняти об'єм концентрованого первинного антитіла, біотинилюючого реагенту та блокуючого реагенту в μL. Біотинилювання первинних антитіл здійснюється в два кроки. Крок 1: у циліндрі для випробування змішують обчислену кількість розчинника, концентрованого первинного антитіла та біотинилюючого реагенту та інкубують 15хв при кімнатній температурі. Крок 2: в циліндр для випробування додають розраховану кількість блокуючого реагенту і протягом 5хв інкубують при кімнатній температурі. 6 Таке біотинильоване первинне антитіло тепер готове до використання. Примітка: біотинильовані антитіла, що містять блокуючий реагент можна використовува ти лише в день приготування. Біотинильовані антитіла без блокуючого реагенту можна використовувати протягом 2 тижнів за умови зберігання при температурі +2-8°С. Після інкубації з біотинильованими антитілами зрізи промивають у PBS тричі по 5хв.Усі зрізи обробляють стрептавідин - пероксидазою (код К 3954) протягом 15хв з розрахунку 150μl на одне скельце, та промивають у PBS 5хв. Потім зрізи обробляють DAB + хромоген протягом 5хв з розрахунку 150μl на одне скельце, промивають 5хв у PBS та 5хв у дистильованій. Після цього демонтують з касет Coverplate і вміщують у контейнер з дистильованою водою. Для виявлення клітинних структур зрізи підфарбовують протягом 1-3хв гематоксиліном Маєра (код S 3309, Microm, Germany) та промивають двічі у проточній воді. Зрізи заводять у водне середовище і накривають накривним скельцем. Максимальна тривалість імуногістохімічного фарбування становить 4-5год. Описаним способом фарбують позитивний контроль та перший дослідний зріз. При фарбування негативного контролю та другого дослідного зрізу для приготування біатинильованого реагенту використовуємо реактивні моноклональні мишачи Ат підкласу IgG2b, синтезовані у тканинній культурі, їх розводять до такої ж кінцевої концентрації, як і первинні антитіла. Інтерпретація результатів. В позитивних випадках патологічний пріон-збудник ГЕ ВРХ мікроскопічно виявляється у вигляді гранул , зерен, бляшок, зірочок коричневого кольору, розташованих перинейрально, внутрінейрально (навколо ядра) та лінійно - за ходом відростків нейроцитів. Мозкова тканина зафарбована в світло-синій колір. Діагноз вважається негативним якщо при мікроскопічному дослідженні в тканині мозку патологічний пріон не виявлено. Джерела інформації: 1. СОУ 85.20-37-568:2007. Гістологічний метод діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби. 2. Standard operating procedure for detection of prion protein (PrP) in brain and lymphoid tissue of ruminant livestock using monoclonal antibody immunohistochemistry. - 2001. - VMRD, Inc., PULLMAN TSEJHC/99. 3. Instructions/ The DAKO ARK™ (Animal Research Kit), Peroxidase. For Mouse Primary Antibodies. 4. Gu J, et al. A primary-secondary antibody complex method of immunohistochemistry using rabbit polyclonal antibodies to detect antigens in rabbit tissue. Cell Vision, 1995. - 2 (1): 52. 5. Sabine Debeer, Thierry Baron, Anna Bensik. Neuropathological characterization of French bovine spongiform encephalopathy cases //Histochem Cell Biol. - 2003. - 120: 513-521. 7 Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун 33945 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601