Спосіб виявлення специфічних антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби методом імуноферментного аналізу

Спосіб виявлення специфічних антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби методом імуноферментного аналізу, що включає використання набору діагностичних компонентів, який відрізняється тим, що використовують вірус, одержаний шляхом одночасного культивування ембріональних клітин нирки ВІВЦІ З клітинами лімфовузла великої рогатої худоби, очищений і концентрований методом адсорбційної та молекулярно-ситової хроматографії на макропористих сорбентах, облік результатів автоматизований Винахід відноситься до ветеринарної мікробіологи і біотехнологм, зокрема до лабораторної діагностики, призначеної для виявлення специфічних антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби, може бути використаний для експресної діагностики захворювань лейкозної етіології Аналог винаходу - близьким за технічним рішенням до об'єкту, що заявляється є реакція зв'язування комплементу (РЗК) Принцип реакції заключається втому, що антитіла приймають участь у зв'язуванні комплементу з вірусними поліпептидами Недоліком вказаного методу є те, що він тривалий (2 доби), недостатньо чутливий та специфічний Крім того, в РЗК не можна досліджувати антикомплементарні сироватки крові, які часто зустрічаються Прототипом винаходу є реакція імунодифузм у гелі агару (РІД), де використовується, як антиген культура клітин FLK після 48-72 годин культивування у подальшому концентруванні за допомогою ультрафільтраційного апарату на порожнистих волокнах Лейкозний антиген для РІД використовують рідкий або леофілізований Специфічні преципітуючі сироватки відбирають від корів-донорів за гематологічними та РІДпозитивними показниками Постановка реакції імунодифузм Сольову суміш з агаром переносять у колбу ємкістю 300 500см3, додають 100см3 дистильованої води і перемішують 15-30 сек Колбу з суспензією вміщують у киплячу водяну баню й витримують 50-60 хв , періодично перемішуючи вміст до повного розчи нення Розтоплений агар - гель розливають на предметні скельця по 1,8-2,0см, які ставлять на столі, що має чітку горизонтальну поверхню Формування щільного шару гелю, що придатний для прорізування лунок, відбувається за 15-20 хв За допомогою прямокутного штампу прорізують лунки в гелі, не допускаючи його відшарування від предметного скельця Утворені гелеві диски видаляють з лунок Діаметр кожної лунки - 5мм, відстань між центральною і периферійними лунками - Змм Рідкий антиген для реакції імунодифузм використовують без попередньої підготовки, леофілізований антиген розчиняють (1 1) у розріджувачі Для прискорення розчинення антигену його розмішують у флаконі скляною паличкою Специфічну преципітуючу сироватку використовують без попередньої підготовки Антиген і специфічну преципітуючу сироватку вносять у центральні лунки, а випробовувані сироватки в лунки периферичних рядів Після завершення постановки реакції предметні скельця поміщують у камеру (ексикатор, стерилізатор) з водою, що налита шаром 1 - 2см між дном камери та підставкою для скла Камеру ставлять у термостат з температурою нагрівання 2426°С Облік результатів реакції імунодифузм проводять через 48-72 години Для цього предметні скельця з компонентами продивляються у промені світла освітлювача (ОИ -19, ОИ - 24 або ш) Для зручності обліку рекомендується використовувати 00 ю ю 55284 бінокулярну лупу БЛ - 2 із збільшенням в 2,5 Результати реакції імунодифузм з випробовуваними сироватками оцінюють у порівнянні з реакціями антигену та специфічної преципітуючої сироватки Позитивна реакція імунодифузм з специфічною преципітуючою сироваткою характеризується утворенням чітко обмеженої лінії білого кольору різного ступеня інтенсивності (контрольна ЛІНІЯ) МІЖ лунками, заповненими антигеном та специфічною сироваткою При відсутності цієї лінії оцінку результатів реакції імунодифузм з випробовуваними сироватками не проводять Застосування РІД для діагностики лейкозу надто тривала (48-72 години), реакція недостатньо чутлива, трудомістка при масових серологічних дослідженнях, недостатньо об'єктивний візуальний облік результатів реакції імунодифузм (2) В основу винаходу, що передбачається поставлено завдання розробити спосіб шляхом розроблення набору діагностикумів для виявлення специфічних антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби методом імуноферментного аналізу, який дасть можливість уникнути перелічених недоліків прототипу Поставлене завдання вирішується завдяки тому, що для постановки експресного методу (2-3 години) імуноферментного аналізу використовується культуральний хроматографічно очищений і концентрований лейкозний антиген За даними параметрами рішення, що заявляється відповідає критерію "суттєві ознаки" Суть винаходу в тому, що до набору входить лейкозний антиген, одержаний при одночасній культивації ембріональних клітин нирки ВІВЦІ З клітинами лімфосаркоматозного лімфовузла великої рогатої худоби, очищення і концентрування якого проводили, використовуючи адсорбційну та молекулярно-ситову хроматографію на макропористих сорбентах (МПС) Висока чутливість і специфічність способу з використанням методу імуноферментного аналізу (ІФА) досягається при використанні очищених від сторонніх білків концентрованих антигенів, правильно підібраних параметрів тест-системи, а саме сенсибілізуючої дози антигену, рН інкубаційного буферного розчину, часу й температури адсорбції антигену на твердофазному носи Найкраще адсорбція лейкозного вірусу проходила при рН 2,4-5,9 на макропористих сорбентах пор 235 А, оптимальна швидкість подачі культуральної вірусної суспензії на колонку становила 5см3/хв максимальна десорбція вірусу з колонки була при використанні десорбційного буферного розчину 0,5М трис і М NaCL рН 8,6-8,9 Одержаний елюат після адсорбційної хроматографії, з метою повного звільнення вірусу від тканинних білків, піддавали гельхроматографічному очищенню на модифікованому полівшілпіралідоном МПС С 2 При цьому завдяки вибору оптимальних умов вдалося досягти чіткого виділення вірусної фракції від фракції клітинних білків Після одержання очищеного, концентрованого вірусу лейкозу використовували його для сенсибілізації полістиролових мікропланшет робочим розведенням 1 1000 в умовах 0,01 М калій фосфатного буферного розчину з 0.15М NaCL рН 7,1-7,4, протягом 18 годин при t 4°C Для блокування вільних сорбційних зон після адсорбції очищеного антигену використовували 3%-ний розчин альбуміну, який одержували на рідинному хроматографі, за методикою розробленою нами Одержані таким чином сенсибілізовані мікропланшети використовували для виготовлення набору діагностикумів для імуноферментного аналізу при діагностиці лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ) Сенсибілізовані планшети можуть використовуватись протягом двох років В набір увійшли полістиролові мікропланшети, сенсибілізовані очищеним антигеном вірусу лейкозу великої рогатої худоби, сироватка крові позитивна до вірусу лейкозу ВРХ, сироватка крові негативна, антивидовий імунопероксидазний кон'югат та індикаторна система (ортофенілендіамін) Використання набору для виявлення антитіл до вірусу лейкозу ВРХ методом імуноферментного аналізу У лунки планшет, що сенсибілізовані лейкозним антигеном (ряд А) вносять по 0,1 мл позитивної, (ряд В) негативної до лейкозу та у (ряди C,D,E,F,G,H) ДОСЛІДНІ сироватки крові свиней Потім їх розтитровують методом подвійних розведень, шкубують у термостаті 1 годину при t 37°C після цього планшети відмивають твін-фосфатнобуферним розчином (ТФБР) та вносять по 0,1 мл антивидового імунопероксидазного кон'югату, знову шкубують 1 годину при t 37°C і знову відмивають ТФБР та вносять субстратний розчин (ортофенілендіамін), спостерігають за забарвленням ферментативної реакції При досягненні забарвлення позитивного контролю реакції зупиняють додаванням до кожної лунки по 30-35мкл IN HCL, після чого проводять облік реакції за допомогою автоматичного спектрофотометра або візуально по інтенсивності забарвлення ферментативної реакції При обліку реакції ІФА на спектрофотометрі, якщо показник оптичної ЩІЛЬНОСТІ вище 0,15 реакція позитивна Експериментальні дослідження показали, що при використанні розробленого способу з набором діагностикумів для ІФА являється високочутливим, специфічним, тривалість дослідження 2-3 години, використання сенсибілізованих планшет дає можливість проводити масові обстеження свинарських господарств з лікувально-профілактичною метою Спосіб постановки реакції з використанням набору автоматизований, мало трудомісткий Таким чином розроблений спосіб виявлення специфічних антитіл до вірусу лейкозу великої рогатої худоби методом імуноферментного аналізу, з використанням розробленого набору діагностикумів, дає можливість за 2-3 години провести діагностику захворювання тварин на лейкоз, реакція високочутлива, специфічна, облік реакції автоматизований, може застосовуватись при масових діагностичних обстеженнях господарств Спосіб знайде застосування у виробничих лабораторіях ветеринарної медицини та науководослідних установах, а також в господарствах при проведенні оздоровчих заходів від лейкозу великої рогатої худоби Використана література 1 Валиков А Ф , Шишков В П , Бурба Л Г Лей 5 55284 6 коз крупного рогатого скота (вирусологические чественные опухоли животных аспекты) Москва, ВНИИТЭИСХ, 1980 промиздат", 1988, с 173 2 Шишков В П , Бурба Л Г Лейкозы и злока Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24 Москва, "Агро