Тест-система “dia-amplisens sars” для виявлення рнк коронавірусу sars методом зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції

Тест-система для виявлення РНК коронавірусу SARS методом зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції, що включає синтезування на основі олігонуклеотидних праймерів з вірюнної РНК-матриці вірусу SARS за допомогою зворотної транскриптази вірусоспецифічної комплентарної ДНК, фрагмент якої потім ампліфікують в полімеразній ланцюговій реакції, яка відрізняється тим, що використовують метод екстракції РНК коронавірусу SARS, праймери та фрагменти ДНК внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ), які дозволяють отримувати SARS-специфічні амплі Винахід належить до генної інженери, медицини та може бути використаний для проведення досліджень з метою виявлення РНК вірусу SARS (важкого гострого респіраторного синдрому), якій призводить до атипової пневмонії Відомий тест для виявлення вірусу SARS розроблено компанією "Focus Technologies" (США) [1] З вірюнної РНК-матриці вірусу SARS за допомогою зворотної транскриптази (ЗТ) синтезується вірусоспецифічна кДНК, яка потім ампліфікується (багатократно копіюється) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) РНК виділяють з ЮОмкл проби за допомогою автоматизованої системи NuchSens (bioMeneux) Олігонуклеотидні праймери, використані для ампліфікації та секвенування, отримано з відкритої рамки зчитування 1Ь для висококонсервативного гена полімерази коронавірусів В Україні тест-системи для виявлення коронавірусу SARS до теперішнього часу не існувало зворотної транскрипції, ампліфікації ділянки ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, електрофоретичного аналізу продуктів ПЛР та обліку результатів ПЛР-аналізу Приклад 1 Проведення аналізу КЛІНІЧНИХ проб Виділення та очистка РНК з КЛІНІЧНИХ проб та ДНК контрольних зразків В необхідну КІЛЬКІСТЬ пробірок додають по 5мкл внутрішнього контрольного зразку (ВКЗ) та 450мкл лізуючого розчину, а також по ЮОмкл досліджуваної проби В пробірку негативного контролю (НК) вносять ЮОмкл негативного контрольного зразку (НКЗ) В пробірку позитивного контролю (ПК) вносять 90мкл НКЗ та Юмкл позитивного контрольного зразку (ПКЗ SARS) Потім в кожну пробірку додають по 25мкл сорбенту і ретельно перемішують Після центрифугування при Ютисоб/хв відаляють Супернатант, відмивають осад розчином для промивки та етанолом, потім додають в пробірки ацетон, ретельно ресуспендують сорбент і центрифугують при Ютис об/хв Супернатант повністю віддаляють Сорбент підсушують при 60°С протягом 5-1 Охв Додають в пробірки по 50мкл РНК-елюєнту Знов центрифугують при 1213тис об/хв протягом 1хв Супернатант містить чисті РНК коронавірусу та ДНК контрольних зразків В основу винаходу покладено завдання створити тест-систему «DIA-AmphSens SARS» на основі оригінальних олігонуклеотидних праймерів для виявлення РНК коронавірусу SARS методом зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції Матеріалом для дослідження при обстеженні амбулаторних хворих служать біологічна рідина та виділення з носоглотки, мазки з ротової порожнини, проби фекалій людини Аналіз за допомогою ПЛР складається з чотирьох стадій виділення РНК, отримання комплементарної ДНК (кДНК) на матриці РНК в ході реакції кони та ВКЗ розміром 221 п н та 400 п н ВІДПОВІДНО Проведення реакції зворотної транскрипції Готують мікропробірки з реакційною сумішшю RT-mix з РНК-елюєнтом та ревертазою і туди до (О 62794 дають по Юмкл РНК-проби Обережно перемішувірусів, аденовірусів людини, вірусів грипу типів А ють і ставлять в амліфікатор (термостат) при 37°С та В, що виділені від птахів та тварин, респіраторна ЗОхв Одержану в реакції ЗТ кДНК використоно-синцитіального вірусу типу А, вірусів парагрипу вують для послідуючої постановки ПЛР 1, 2, та 3 типів, ентеровірусів, які були представлені ФГУ ВДНІІ Контролю, Стандартизації та СерПроведення полімеразної ланцюгової реакції тифікації Ветеринарних Препаратів - Центру якості В пробірки з ПЛР-сумішшю-1 та воском для ветеринарних препаратів та кормів, а також ДІСК ампліфікації ДНК досліджуваних та контрольних їм Л А Тарасевича (Москва, РФ) Всього було прозразків додають ПЛР-суміш-2 та масло для ПЛР контрольовано 59 штамів вірусів та КЛІНІЧНИЙ маПід масло додають по Юмкл кДНК зразків, що бутеріал від здорових людей -52 зразка змивів з ноли отримані в реакції ЗТ РНК та контролі (ПКЗ соглотки та ЗО зразків фекалій кДНК) Як негативний контроль замість ДНК-проби в підготовлену пробірку вносять Юмкл ДНКСпецифічність пропанованої тест-системи буферу Ампліфікацію проводять за програмою, становила 100%, а аналітична чутливість тест3 яка додається до ампліфікатора системи -10 геном-еквівалент/мл вірусу SARS Таким чином, пропонована тест-система заЕлектрофоретичний аналіз продуктів ПЛР безпечує виявлення вірусу SARS Тест-система Після закінчення ампліфікації пробірки зі зразнадійна в роботі, проявляє високу чутливість та ками досліджують стандартним методом електроспецифічність форезу в агаразному гелі Облік результатів ПЛРаналізу проводять згідно з "Інструкцією по викориВикористана література станню тест-системи" Наявність або відсутність 1 М К Mosch Focus Technologies Offers First на електрофореграммі специфічних смуг амплікоCommercial Laboratory Test for Severe Acute Respiнів кДНК розміром 221 п н свідчить про присутність ratory Syndrome (SARS) вірусної РНК SARS в досліджуваних зразках http www focustechnoi ogies com/catalog_focus 2 W J Bellini SARS-CoV Specific RT-PCR Приклад 2 Визначення чутливості та специфіPrimers CDC DVRD/NCID/CDC 2003 P1-2 чності пропонованої тест-системи 3 Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Специфічність тест-системи визначалась при Laborator Diagnostic Tests 29 04 2003 тестуванні панелі різних штамів коронавірусів, http//www who mt/csr/sars/diagnostictests/en/ ротавірусів людини та тварин, астровірусів, норо Комп'ютерна верстка М Мацело Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119