Спосіб діагностики хронічних захворювань органів дихання у дітей

Спосіб діагностики хронічних захворювань органів дихання у дітей, що включає відбір проби периферичної крові, дослідження в лімфоцитах крові активності ферментів a-гліцерофосфат- і сукцинатдегідрогенази кількісним цитохімічним шляхом, оцінку зображення клітини лімфоциту за числом, площею, габаритами, оптичною щільністю, кластероутворенням гранул, відстанню між ними у полі зору мікроскопа й цитохімічний аналіз активності ферментів, який відрізняється тим, що додатково досліджують активність ферментів лактатдегідрогенази та встановлюють під час цитохімічного аналізу активності ферментів мітохондріальну недостатність на ранній фазі патології, якщо активність сукцинатдегідрогенази меншає на 1020% на тлі підвищення активності лактатдегідрогенази на 20-30% і норми α-гліцерофосфатдегідро U 2 (19) 1 3 39337 клітинного енергообміну в лейкоцитах під час захворювань органів дихання. Ферментний статус лімфоцитів периферичної крові не менш вірогідно відбиває стан полісистемної мітохондріальної недостатності. Поряд із цим, дослідження активності ферментів a-ГФДГ в лімфоцитах периферичної крові кількісним цитохімічним шляхом адекватно відбиває енергетичний обмін клітин і тканин, а постановка цитохімічної реакції є атравматичною, простою, економічно вигідною та більш прийнятною для багаторазового використання. Проте, даному аналогу ще бракує функціональних можливостей та чітких уявлень щодо мітохондріальних дисфункцій на ранніх етапах виникнення хронічних захворювань органів дихання, що дозволяє відзначити замалу вірогідність кінцевого результату. Це пояснюється тим, що спосіб визначає лише «спадкоємну або супутню форми» мітохондріальної недостатності, а фаза (загострення, ремісії) та ступінь активності запального процесу залишаються не визначеними. З іншої сторони, це зумовлене й замалою чутливістю оцінних критеріїв до змін клітинної енергетики, специфічністю коефіцієнта детермінації, недостатністю номенклатури оцінних критеріїв і рівня оцінки зображення клітини лімфоциту. Найбільш близьким серед об’єктів аналогічно призначення до дійсної корисної моделі є спосіб діагностики захворювань органів дихання у дітей, що включає відбір проби периферичної крові, дослідження в лімфоцитах крові активності ферментів a-ГФДГ і сукцинатдегідрогенази (СДГ) кількісним цитохімічним шляхом, оцінку зображення клітини лімфоциту за числом, площею, габаритами, оптичною щільністю, кластероутворенням гранул, відстанню між ними у полі зору мікроскопа й цитохімічний аналіз активності ферментів. У відповідності з прототипом, за допомогою зображення клітини лімфоциту також визначають середню активність його популяцій, коефіцієнти асиметрії, ексцесу, варіації та ентропії інформації, як параметри розподілу ферментів СДГ, a-ГФДГ, обчислюють інтегральний цитохімічний індекс активності запального процесу, а під час цитохімічного аналізу активності ферментів, за результатом диференціювання цитохімічного індексу, діагностують максимальний, помірний, або мінімальний ступінь активності запального процесу бронхолегеневої системи [3]. Цей спосіб відрізняється від попереднього аналогу розширенням представництва досліджуваних ферментів та збільшенням числа оцінних компонентів зображення клітини лімфоциту, які більш достовірно корелюють з активністю окислювально-відновних ферментів на тлі захворювань органів дихання у дітей, що декілька збільшує вірогідність кінцевого результату (р=0,82). З технічної точки зору спосіб розпізнає не лише фазу (загострення, ремісії) але й ступень активності захворювань органів дихання у дітей, що ін формує про розширення його функціональних властивостей і має значущість при помірному ступені активності запального процесу при плануванні оптимальної ефективності парентеральної чи пероральної антибактеріальної терапії. Проте, застосування підсумкового цитохімічного індексу в 4 оцінці активності запального процесу не надає відповіді щодо мітохондріальної дисфункції на ранніх етапах виникнення хронічного захворювання, від чого стримується одержання більш вірогідного кінцевого результату. Це зумовлене відсутністю оцінки виснаження мітохондрій, як найбільш інформативної ланки морфофункціонального гомеостазу тканин серед органел цитоплазми, або недостатнім використанням інформативності досліджуваних ферментів СДГ і a-ГФДГ. Окрім цього, способу бракує чутли вості, необхідної для реєстрації мітохондріальної дисфункції (змін клітинної енергетики) на ранніх етапах виникнення хронічного захворювання. В основу дійсної корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб діагностики хронічних захворювань органів дихання у дітей, застосування котрого дозволило б шляхом збільшення чутливості до змін клітинної енергетики за рахунок розширення представництва досліджуваних мітохондріальних ферментів і поглиблення інтерпретації їхньої активності збільшити вірогідність кінцевого результату на ранніх етапах виникнення патології. Поставлена задача вирішується тим, що при використанні відомого способу діагностики хронічних захворювань органів дихання у дітей, що включає відбір проби периферичної крові, дослідження в лімфоцитах крові активності ферментів a-гліцерофосфат- і сукцинатдегідрогенази кількісним цитохімічним шляхом, оцінку зображення клітини лімфоциту за числом, площею, габаритами, оптичною щільністю, кластероутворенням гранул, відстанню між ними у полі зору мікроскопа й цитохімічний аналіз активності ферментів, відповідно до корисної моделі, додатково досліджують активність ферментів лактатдегідрогенази та встановлюють під час цитохімічного аналізу активності ферментів мітохондріальну недостатність на ранній фазі патології, якщо активність сукцинатдегідрогенази меншає на 10-20% на тлі підвищення активності лактатдегідрогенази на 20-30% й норми a-гліцерофосфатдегідрогенази, або якщо активності сукцинатдегідрогенази й лактатдегідрогенази зростають на 15-20% на тлі зниження активності aгліцерофосфатдегідрогенази на 10-20%, або якщо активність лактатдегідрогенази зростає відносно норми a-гліцерофосфатдегідрогенази, або якщо активності сукцинатдегідрогенази і aгліцерофосфатдегідрогенази меншають на 20-30% відносно норми лактатдегідрогенази, або якщо спостерігають збільшення кластероутворення гранул лімфоциту більше ніж на 70%, або якщо при оцінці зображення клітини лімфоциту виявляють перевагу дрібних гранул у ферментах aгліцерофосфат-, сукцинат- і лактатдегідрогенази понад 80%, або якщо встановлюють зниження щільності їх забарвлення, або якщо очевидне зниження числа гранул a-гліцерофосфат-, сукцинат-, лактатдегідрогенази і виражене кластероутворення, або якщо спостерігають збільшення активних гранул a-гліцерофосфат- і зниження числа активних гранул сукцинатдегідрогенази. Причинно-наслідковий зв’язок сукупності відмітних ознак дійсного способу з вищезазначеним 5 39337 технічним результатом полягає у додатковому дослідженні активності ферменту лактатдегідрогенази (ЛДГ), подальшій оцінці активностей мітохондріальних ферментів a-ГФДГ, СДГ, ЛДГ і оцінки зображень клітини лімфоциту, що збільшує чутливість до змін клітинної енергетики за рахунок збільшення інтерпретації аналітичних параметрів. Завдяки розширенню інформаційної основи, відповідно збільшується вірогідність кінцевого результату, насамперед, на ранніх етапах виникнення бронхолегеневої патології, переважно, за рахунок оцінки стану ланки морфофункціонального гомеостазу тканин, що найбільш вірогідно демонструє зміни клітинної енергетики. Тобто на основі цитохімічного аналізу лімфоцитів периферійної крові з’являється можливість оцінити функцію мітохондрій за активністю a-ГФДГ, СДГ і ЛДГ і зображень їхніх клітин, які корелюють з етіопатогене-зом хронічного бронхолегеневого захворювання та виснаженням енергетичних ресурсів клітин лімфоцитів. Необхідність дослідження мітохондріальних змін хронічних захворювань органів дихання у дітей полягає в тому, що порушення клітинних й органних систем часто призводить до мітохондріальних змін вторинного порядку, що ускладнює діагностику енергетичних порушень і виявлення первинних змін органел, пов’язаних з патологією генетичного контролю мітохондріальних білків. Так, відбиття інтенсивності біоенергетичного обміну, у вигляді зниження активності СДГ на 1020% на тлі підвищення активності ЛДГ на 20-30% і нормативних значень a-ГФДГ, інформує про компенсаторну активацію гліколізу, в умовах зниження активності процесів аеробного обміну тому, що корелює з високою активністю ендобронхіту у дітей і поширеним бронхолегеневим процесом. Піднесення активності СДГ та ЛДГ на 15-20% на тлі зниження активності a-ГФДГ на 10-20% свідчить про пригнічення анаеробного та компенсаторного напруження аеробного гліколізу та має вірогідну корелюючу залежність від показника функції зовнішнього дихання і є ендогенним фактором ризику загострення хвороби. Зростання активності ЛДГ відносно норми aГФДГ при виявленні мітохондріальної недостатності набуває статус інформативного фактора у зв’язку з наявністю енергетичного напруження процесів гліколізу, що проходять в анаеробних умовах і є менш енергетично вигідними. Зменшення активності СДГ та a-ГФДГ на 2030%, відносно нормативних значень ЛДГ є фактом функціональної дисфункції лімфоцитів на тлі хронічного гіпоксичного ураження і відображає ефективність роботи мітохондріального апарату. Візуальний цитохімічний аналіз лімфоциту сприяє виявленню вагомих змін активності мітохондріальних ферментів індивідуальноваріабельного характеру і відповідають комбінації різних порушень клітинно-енергетичного обміну. Збільшення кластероутворення гранул, більше чим на 70% свідчить про патологічне накопичення гранул біля одного з полюсів клітини, а від того є ранньою ознакою розвитку енергетичного дефіциту. 6 Перевага дрібних гранул у всі х ферментах лімфоциту більше чим на 80% інформує про найбільш глибоку ступінь пошкоджень мітохондрій та їх функціональної активності. Зниження щільності забарвлення ферментів a-ГФДГ, СДГ, ЛДГ відбиває наявність гіпофункції мітохондрій за рахунок зниження інтенсивності ферментних реакцій, забезпеченість клітин енергоємними сполученнями. Зниження кількості гранул a-ГФДГ, СДГ, ЛДГ у їх сполученні в кластерах вказує на глибокі ураження мітохондріальнго апарату клітини. Інформативна значущість зниженої активності гранул СДГ та збільшеної активності гранул aГФДГ зв’язується з фактом роз’єднання процесів тканинного дихання та окислювального фосфорилювання і відображає зниження активності мітохондріального апарату в цілому. За цих умов досягається підвищення інформативності (за рахунок збільшення числа критеріїв оцінки та їх оціночних комбінацій), вірогідності кінцевого результату (р³0,97) і чутливості до змін клітинної енергетики, переважно на рівні первинних змін органел, приблизно у 6-8 разів. Таким чином, сукупність ознак способу діагностики хронічних захворювань органів дихання у дітей є суттєвою та відповідає критерію «новизна», оскільки має причинно-наслідковий зв’язок з підвищенням вірогідності кінцевого результату на ранніх етапах виникнення патології та не випливає з досліджуваного рівня техніки явним чином. Для здійснення способу залучають набори реактивів фірми ТОВ МНВК «Хімтехмаш» ДержНІІ «ІРЕА» (Росія), мікроскоп «Йенавал» (Німеччина). Сутність. Спосіб діагностики хронічних захворювань органів дихання у дітей відтворюється за умов [Пат. 2256926 Росії]. Для збільшення вірогідності кінцевого результату на ранніх етапах виникнення патології (р³0,97), додатково досліджують активність ферментів ЛДГ у лімфі периферичної крові. Використання значень даного маркера у комплексі з a-ГФДГ і СДГ збільшує інформативність діагностичної основи й надає можливість розширеної інтерпретації даних у подальшому. Міто хондріальну недостатність на ранній фазі хронічного захворювання органів дихання констатують на разі, якщо активність СДГ меншає на 1020% на тлі підвищення активності ЛДГ на 20-30% й норми a-ГФДГ, або активності СДГ й ЛДГ зростають на 15-20% на тлі зниження активності a-ГФДФ на 10-20%, або активність ЛДГ зростає відносно норми a-ГФДФ, або активності СДГ і a-ГФДФ зменшуються на 20-30% відносно норми ЛДГ, або спостерігають збільшення кластероутворення гранул, більше чим на 70%, або перевагу дрібних гранул у всі х ферменах лімфоциту понад 80%, або зниження щільності їх забарвлення, або зниження числа гранул a-ГФДФ, СДГ, ЛДГ і виражене кластероутворення, чи зниження числа активних гранул СДГ і збільшення числа активних гранул aГФДФ. Розширення представництва діагностичних критеріїв і кількості оцінних комбінацій підвищує можливість їх інтерпретації та інформативність процесу, а разом із цим - чутливість до змін клі 7 39337 тинної енергетики на рівні первинних змін органел, приблизно у 6-8 разів. Поряд із цим, доопрацювання способу у запропонованому вигляді розширює функціональні можливості прототипу, а виявлення мітохондріальної недостатності у дітей на тлі хронічних захворювань органів дихання сприяє плануванню у подальшому розробці адекватних програм лікування з включенням метаболічних препаратів, впливаючих одночасно на різні ключові ланки клітинного енергообміну. Приклад. Дитина 14 років перебувала у кардіопульмонологічному відділенні 2-ї Дитячої лікарні м.Дніпропетровська з приводу лікування вторинного хронічного бронхіту (за попереднім діагнозом). Відбирали 3 краплі периферичної крої. Цитохімічний аналіз лімфоцитів до лікування: СДГ 15,43 (норма 18,91-21,0), a-ГФДФ - 10,73 (норма 11,49-13,39), ЛДГ - 12,73 (норма 11,55-16,36), превалювання дрібних, неправильної форми, неактивних гранул усі х ферментів сягало 96,7; 100; 96,7%, відповідно. У 83,3% випадків спостерігали перерозподіл гранул у клітині, з концентрацією навколо полюсів клітин, і зменшення площі гранул відносно лімфоциту. Враховуючи наявність змін енергетично метаболізму, у вигляді кількісного зниження активності основних мітохондріальних ферментів a-ГФДФ і СДГ на тлі нормальних значень ЛДГ і превалювання неактивних гранул ферментів клітини, констатували наявність мітохондріальної дисфункції. Була розроблена індивідуальна програма щодо корекції мітохондріальної дисфункції на основі додаткового впливу коферментами й вітамінами, що приймають участь в енергетичному обміні, нормалізації біологічних процесів тканевового дихання й окислювального фосфорилювання. З цією метою використали кардонат, кудесан Q10 та аєвіт на протязі 2 місяців. Цитохімічний аналіз лімфоцитів після лікування: СДГ - 19,60, a-ГФДФ - 11,67, ЛДГ - 22,53. Гранули варіювали за розмірами в бік збільшення середніх і крупних. Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 8 Тож, з досліджуваного рівня техніки випливає, що при хронічній бронхолегеневій патології у дітей розвивається вторинна мітохондріальна недостатність, при цьому дослідження активності окисновідбудовних ферментів клітин периферичної крові кількісним цитохімічним шляхом, що адекватно відбиває енергетичний метаболізм, за умов запропонованого рішення задачі і наданого прикладу його клінічного використання сприяють корекції мітохондріальної дисфункції за допомогою енерготропних фармакологічних засобів. Таким чином, запропоноване рішення задачі відповідає умові «промислова придатність», оскільки може бути використаним у сферах лабораторної діагностики, педіатрії або в дитячий пульмонології з можливістю реалізації вищезазначеного технічного результату за допомогою відомих «продуктів», а характеристика заявленого об’єкта, що зазначена у Формулі визначає відмінність його від об’єктів аналогічного призначення і можливість його кваліфікації корисною моделлю процесу. Аналоги: 1. Руководство по клинической эндоскопии. Под. ред. В.С. Савельева, В.М. Буянова, Г.И. Лукомского. - М.: Медицина, 1985. - С.373-390. 2. Способ дифференциальной диагностики полисистемной митохондриальной недостаточности у детей: Пат. 2312347 России, МПК G01N33/50 / Шабельникова Е.И., Сухор уков B.C., Тозилиян Е.В., Клейменова Н.В., Кобринский Б.А., Подольная М.А., Николаева Е.А., Семячкина А.Н. (Россия); Федеральное государственное учреждение Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (Россия); - 2005135487/15; заявл. 16.11.05; опубл. 10.12.05. 3. Способ диагностики воспалительных процессов бронхолегочной системы у детей: Пат. 2256926 России, МПК G01N33/68 / Петричук СВ., Спичак Т.В., Розуваева Ю.В., Шищенко В.М., Крепец В.В., Духова З.Н. (Россия); Государственное учреждение научный центр здоровья детей РАМН (Россия); - №2003120382/15; заявл. 08.07.03; опубл. 20.02.05. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601