Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур м’якої пшениці, стійких до культурального фільтрату gaeumannomyces graminis var. tritici

Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур м'якої пшениці, стійких до культурального фільтрату Gaeumannomyces graminis var. tritici, що включає добір стійких клітинних ліній на селективних середовищах з КФ; експлантацію стійких до КФ калюсів на регенераційне середовище для індукції органогенезу, культивування до отримання проростків, який відрізняється тим, що для прискорення та збільшення частоти регенерації використовують модифіковане регенераційне середовище, у якому індолілоцтова кислота замінена на піклорам та додатково містить низькомолекулярний хітозан, бурштинову, аспарагінову та глутамінову кислоти у таких співвідношеннях компонентів, мг/л: амоній азотнокислий 1650,0 калій азотнокислий 1900,0 кальцій хлористий 440,0 магній сірчанокислий 370,0 калій фосфорнокислий однозамі170,0 3 42324 4 регенерантів, толерантних до офіобольозної коречас культивування та прискорює процес отриманневої гнилі.Поставлена задача вирішується тим, ня рослин - регенерантів. що в способі підвищення регенераційної здатності Таблиця 1 калюсних культур м'якої пшениці, стійких до кульКонцентрація турального фільтрату Gaeumannomyces graminis компонентів регенераційного середовища, мг/л var. tritici, який включає: добір стійких калюсних ліній на селективних середовищах з культуральним фільтратом; експлантацію стійких калюсів на Середовище Середовище регенераційне середовище для індукції органогеКомпоненти 1, МС-1 2 МС-3 (занезу; культивування до отримання проростків; від(прототип) явлене) повідно до корисної моделі для підвищення частоАмоній азотнокислий 1650,0 1650,0 ти регенерації використовують пересадку стійких Калій азотнокислий 1900,0 1900,0 калюсів на певний об'єм (30 мл) модифікованого Кальцій хлористий 440,0 440,0 середовища Мурасіге-Скуга (МС) [Murashige Т., Магній сірчанокислий 370,0 370,0 Skoog F. A revised medium for rapid growth and Калій фосфорнокислий, bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia 170,0 170,0 однозаміщений Planta.-1962.- v.l5.- P.473-497], у якому індолілоцЗалізо сірчанокисле 27,95 27,95 това кислота замінена на піклорам (4-аміно-3,5,6Етилендіамінтетраацетат трихлорпіколінова кислота) та додатково містить натрію 37,23 37,23 низькомолекулярний хітозан (D-глюкозамін, молеБорна кислота 6,2 6,2 кулярною масою 10 кДа), бурштинову, аспарагіноМарганець сірчанокисву та глутамінову кислоти при таких співвідношенлий 22,3 22,3 нях компонентів, мг/л: амоній азотнокислий 1650,0 Цинк сірчанокислий 8,6 8,6 калій азотнокислий 1900,0 Калій йодистий 0,83 0,83 кальцій хлористий 440,0 Натрій молібденовокисмагній сірчанокислий 370,0 лий 0,25 0,25 калій фосфорнокислий однозаміМідь сірчанокисла 0,025 0,025 щений 170,0 Кобальт хлористий 0,025 0,025 залізо сірчанокисле 27,95 Мезоінозит 100,0 100,0 етилендіамінтетраацетат натрію 37,23 Аспарагінова кислота борна кислота 6,2 50,0 марганець сірчанокислий 22,3 Глютамінова кислота 50,0 цинк сірчанокислий 8,6 Хітозан 25,0 калій йодистий 0,83 Бурштинова кислота 5,0 натрій молібденовокислий 0,25 Тіамін-НСІ 1,0 1,0 мідь сірчанокисла 0,025 Піридоксин- НСl 0,5 0,5 кобальт хлористий 0,025 Нікотинова кислота 0,5 0,5 аспарагінова кислота 50,0 глютамінова кислота 50,0 Культуральний фільтрат 500мл 500мл хітозан 25,0 Азотнокисле срібло 10,0 10,0 бурштинова кислота 5,0 Індолілоцтова кислота 1,0 піклорам 1,0 Бензиламінопурин 0,5 0,5 азотнокисле срібло 10,0 Піклорам 1,0 мезоінозит 100,0 Сахароза 30000,0 30000,0 тіамін-НСl 1,0 Агар-агар піридоксин-НС1 0,5 8000,0 8000,0 нікотинова кислота 0,5 Бідистильована вода до І літру до І літру бензиламінопурин 0,5 сахароза 30000,0 Новою, відмінною від прототипу ознакою, є агар-агар 8000,0 прискорене отримання рослин - регенерантів на культуральний фільтрат Gaeumanмодифікованому середовищі (МС-3), у якому Індоnomyces graminis var. tritici 500 мл лілоцтова кислота замінена на піклорам та додатбідистильована вода до 1л. ково містить низькомолекулярний хітозан, буршЗапропонований спосіб характеризується татинову, аспарагінову та глутамінову кислоти у такими суттєвими ознаками: добір стійких калюсних ких співвідношеннях компонентів, мг/л: піклорам ліній на селективних середовищах з культураль1,0, хітозан - 25,0; бурштинова кислота - 5,0; аспаним фільтратом; експлантацію стійких калюсів на рагінова кислота - 50,0; глутамінова кислота - 50,0. регенераційне середовище для індукції органогеВикористання модифікованого регенераційного незу; культивування до отримання проростків. На середовища дозволяє у більш короткий термін та відміну від прототипу, який передбачає (таблиця 1, більшій кількості отримувати стійкі до офіобольозсередовище 1) 3-кратне пасажування ліній на ної кореневої гнилі рослини-регенеранти пшениці ньому, що значно подовжує тривалість індукції для використання їх в селекції на стійкість до біорослин-регенерантів, при здійсненні запропоноватичних стресів і таким чином забезпечити скороного способу регенераційні процеси спостерігачення і спрощення біотехнологічного процесу та ються вже у калюсів 1 пасажу, що значно зменшує зменшити матеріальні затрати для його виконан 5 42324 6 ня.Це стало можливим здійснити на основі даних, Стійкі калюси для індукції органогенезу переноякі були одержані в результаті проведення попесять на регенераційне середовище МС-3 такого редніх досліджень. При використанні модифіковаскладу, мг/л: ного живильного середовища МС (МС-3) відмічаамоній азотнокислий 1650,0 калій азотнокислий 1900,0 ється збільшення кількості калюсів, що регенерують, у 3-5 разів порівняно з прототипом, про що кальцій хлористий 440,0 магній сірчанокислий 370,0 свідчать дані наступної таблиці. калій фосфорнокислий однозаміщений 170,0 Таблиця 2 залізо сірчанокисле 27,95 Частота регенерації у калюснихліній пшениці, етилендіамінтетраацетат натрію 37,23 борна кислота 6,2 стійких до культуральногофільтрату Gaeumannomyces graminis var. Tritici марганець сірчанокислий 22,3 цинк сірчанокислий 8,6 Кількість каКількість калій йодистий 0,83 люсів, що КалювисаВідсоток натрій молібденовокислий 0,25 Середоутворювали джених сна регенерамідь сірчанокисла 0,025 вище рослиникалюсів, лінія ції, % кобальт хлористий 0,025 регенеранти, шт. аспарагінова кислота 50,0 шт. глютамінова кислота 50,0 2 МС-1 100 3 3,0±1,7 хітозан 25,0 7 МС-1 100 5 5,0±2,2 бурштинова кислота 5,0 19 МС-1 100 2 2,0±1,4 піклорам 1,0 24 МС-1 100 4 4,0±2,0 азотнокисле срібло 10,0 2 МС-3 100 10 10,0±3,0 мезоінозит 100,0 7 МС-3 100 22 22,0±4,1 тіамін-НСl 1,0 19 МС-3 100 10 10,0±3,0 піридоксин-НС1 0,5 24 МС-3 100 17 17,0±3,8 нікотинова кислота 0,5 бензиламінопурин 0,5 Спосіб здійснюється наступним чином: на агасахароза 30000,0 ризованому середовищі Мурасіге-Скуга такого агар-агар 8000,0 складу, мг/л: культуральний фільтрат амоній азотнокислий 1650,0 Gaeumannomyces graminis var. tritici 500 мл калій азотнокислий 1900,0 бідистильована вода до 1л. кальцій хлористий 440,0 Живильне середовище (рН-5,8) розливають у магній сірчанокислий 370,0 мірні колби та автоклавують при температурі калій фосфорнокислий однозамі120°С протягом 20 хвилин (тиск 1,05 атм).В стерищений 170,0 льні чашкі Петрі діаметром 80 мм розливають по залізо сірчанокисле 27,95 30 мл регенераційного середовища. На кожну чаетилендіамінтетраацетат натрію 37,23 шку висаджують оптимальну кількість калюсної борна кислота 6,2 маси, яка становить 40 штук агрегатів, діаметром марганець сірчанокислий 22,3 до 3-5мм на відстані 8-10 мм один від одного. Мацинк сірчанокислий 8,6 теріал культивують при температурі 24 ± 2°С, освікалій йодистий 0,83 тленні 3-4 клк протягом пасажу до появи нормальнатрій молібденовокислий 0,25 но розвинутих пагонів. Отримані рослинимідь сірчанокисла 0,025 регенеранти переносять на середовище для укокобальт хлористий 0,025 рінення.Порівняльний аналіз заявленого способу з аспарагінова кислота 50,0 прототипом показав, що заявлений спосіб відрізглютамінова кислота 50,0 няється новими суттєвими ознаками, які полягахітозан 25,0 ють в тому, що для підвищення регенераційної бурштинова кислота 5,0 здатності та прискореного отримання рослинпіклорам 1,0 регенерантів, стійкі калюси пересаджують на моазотнокисле срібло 10,0 дифіковане середовище (МС-3), у якому індоліломезоінозит 100,0 цтова кислота замінена на піклорам та додатково тіамін-НСl 1,0 містить низькомолекулярний хітозан, бурштинову, піридоксин-НС1 0,5 аспарагінову та глутамінову кислоти у таких співнікотинова кислота 0,5 відношеннях компонентів, мг/л: хітозан - 25,0; бубензиламінопурин 0,5 рштинова кислота - 5,0, аспарагінова кислота сахароза 30000,0 50,0, глютамінова кислота - 50,0. Сукупність заявагар-агар 8000,0 лених ознак прискорює процес отримання стійких культуральний фільтрат до офіобольозної кореневої гнилі рослин500 мл Gaeumannomyces graminis var. tritici регенерантів м'якої пшениці у 3 рази та збільшує їх бідистильована вода до 1л. кількість у 3-5 разів і таким чином забезпечує скометодом прямої клітинної селекції добирають рочення біотехнологічного процесу і зменшення стійкі калюсні лінії, які характеризуються нормальматеріальних затрат для його виконанним приростом біомаси на селективному середоня.Заявлений спосіб підвищення регенераційної вищі та зберігають морфогенетичний потенціал. 7 42324 8 здатності стійких до культурального фільтрату влена ефективність його застосування. ВикорисGaeumannomyces graminis var. tritici калюсних тання заявлених ознак забезпечує скорочення культур м'якої пшениці шляхом використання мобіотехнологічного процесу і зменшення матеріальдифікованого живильного середовища дозволяє них затрат для його виконання. Може бути викориприскорити процес отримання толерантних до станий для одержання толерантних рослинофіобольозної кореневої гнилі рослинрегенерантів в біотехнології та селекції м'якої регенерантів та збільшити їх кількість чим і обумопшениці. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601