Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур цукрових буряків з комплексною стійкістю до абіотичних стресових чинників

Спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур цукрових буряків з комплексною стійкістю до абіотичних стресових чинників, який включає: добір резистентних калюсних ліній на селективних середовищах з хлоридом натрію, загартування калюсів низькими позитивними температурами та короткочасну обробку негативними температурами, швидке нарощування калюсної маси, експлантацію резистентних калюсів на регенераційне середовище для індукції органогенезу, культивування до отримання мікророзеток, який відрізняється тим, що для швидкого нарощування біомаси використовують модифіковане середовище, яке додатково містить азотнокисле срібло та піклорам при таких співвідношеннях компонентів, мг/л: амоній азотнокислий - 825,0, калій азотнокислий - 950,0, кальцій хлористий - 220,0, магній сірчанокислий U 2 30370 1 3 рослин-регенерантів для залучення в селекційний процес. В основу винаходу поставлена задача підвищення регенераційної здатності резистентних калюсних культур цукрових буряків для прискореного отримання та збільшення кількості рослин-регенерантів, толерантних до комплексу абіотичних стресових чинників, зокрема хлоридного засолення та низьких позитивних температур. Поставлена задача вирішується тим, що в способі підвищення регенераційної здатності калюсних культур цукрових буряків з комплексною стійкістю до абіотичних стресових чинників, який включає: добір резистентних калюсних ліній на селективних середовищах з хлоридом натрію; загартування калюсів низькими позитивними температурами та короткочасну обробку негативними температурами; швидке нарощування калюсної маси; експлантацію резистентних калюсів на регенераційне середовище для індукції органогенезу; культивування до отримання мікророзеток; відповідно до винаходу для швидкого нарощування маси калюсних культур використовують пересадку резистентних калюсів на певний об'єм (30мл) модифікованого середовища Доллі-Сандерса (Doley W.P., Sounders G.W. Hormone-free medium will support callus production and subsequent shoot regeneration from whole leaf explants in some sugar beet (Beta vulgaris L.) populations //Plant Cell Rep. - 1989. - 8, N4. - P.222-225), яке додатково містить AgNO3 10мг/л та піклорам (4-аміно-3,5,6трихлорпіколінова кислота) - 1мг/л, при таких співвідношеннях компонентів, мг/л: амоній азотнокислий - 825,0; калій азотнокислий - 950,0; кальцій хлористий - 220,0; магній сірчанокислий 185,0; калій фосфорнокислий, однозаміщений 85,0; залізо сірчанокисле 13,6; етилендіамінтетраацетат натрію - 18,7; борна кислота - 3,1; марганець сірчанокислий - 11,2 ; цинк сірчанокислий - 4,3; калій йодистий - 0,42; натрій молібденово кислий - 0,13; мідь сірчанокисла - 0,013; кобальт хлористий - 0,013; мезоінозит - 100,0; гліцин - 2,0; тіамін - НСl - 1,0; піридоксин НСl - 0,5; нікотинова кислота - 0,5; хлорид натрію - 2000; сахароза -30000,0; агар-агар -8000,0; бідистильована вода - до 1 літру. Через 20 діб нарощену біомасу переносять на регенераційне середовище для індукції органогенезу, за основу якого взято" середовище Фрейтага (Freytag A.H., Anand S.C., Rao-Arelli A.P., Owens L.D. An improved medium for adventitions shoot formation and callus induction in Beta vulgaris L. In vitro II Plant Cell Rep. - 1988. - 7, №1. - P.3034.), збільшують у 2 рази кількість 6бензиламінопурину, вилучають всі вітаміни та індолилмасляну кислоту та додатково вводять абсцизову кислоту і дріжджовий екстракт при таких співвідношеннях компонентів, мг/л: амоній азотнокислий - 1650,0; калій азотнокислий 1900,0; кальцій хлористий - 440,0; магній сірчанокислий - 370,0; калій фосфорнокислий, однозаміщений - 170,0; залізо сірчанокисле -27,95; 30370 4 етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота - 6,2; марганець сірчанокислий - 22,3; цинк сірчанокислий - 8,6; калій йодистий - 0,83; натрій молібденово кислий - 0,25; мідь сірчанокисла 0,025; кобальт хлористий - 0,025; L-аргінін - 40,0; L-аспарагін - 40,0; L-гліцин - 20,0; L- глютамін 60,0; L-фенілаланін -20,0; L-триптофан - 40,0; бензиламінопурин - 0,8; хлорид натрію - 2000; абсцизова кислота - 0,5; дріжджовий екстракт 100,0; сахароза - 30000,0; агар-агар - 8000,0; бідистильована вода - до 1л. Запропонований спосіб характеризується такими суттєвими ознаками: добір резистентних калюсних ліній на селективних середовищах з хлоридом натрію; загартування калюсів низькими позитивними температурами та короткочасна обробка негативними температурами; швидке нарощування калюсної маси резистентних форм. На відміну від прототипу, який передбачає посадку калюсів на середовище ДС-2 (таблиця 1, середовище 1) та пасажування ліній на ньому протягом 80 діб, що значно подовжує тривалість отримання калюсної маси, при здійсненні запропонованого способу таку саму масу калюсу отримують вже через 20 діб, що значно зменшує час культивування та прискорює процес отримання рослин-регенерантів. Концентрація компонентів регенераційного се Компоненти Амоній азотнокислий Калій азотнокислий Кальцій хлористий Магній сірчанокислий Калій фосфорнокислий, однозаміщений Залізо сірчанокисле Етилендіамінтетраацетат натрію Борна кислота Марганець сірчанокислий Цинк сірчанокислий Калій йодистий Натрій молібденовокислий Мідь сірчанокисла Кобальт хлористий Мезоінозит Гліцин Тіамін-НСl Піридоксин-НСl Нікотинова кислота Хлорид натрію Азотнокисле срібло Піклорам Сахароза Агар-агар Бідистильована вода Через 20 діб нарощену біомасу переносять на регенераційне середовище РВ (таблиця 2, середовище 1) для індукції органогенезу. На Середо (пр 3 8 до 5 відміну від прототипу, який передбачає 3-кратне пасування ліній на ньому, що значно подовжує тривалість індукції рослин-регенерантів, при здійсненні запропонованого способу регенераційні процеси спостерігаються вже у калюсів 1 пасажу, що значно зменшує час культивування та прискорює процес отримання рослин регенерантів. 30370 6 середовищі Фрейтага (РВ-21), у якому збільшена у 2 рази кількість 6-бензиламінопурину, вилучені всі вітаміни та індолилмасляна кислота та додатково введені абсцизова кислота та дріжджовий екстракт у таких співвідношеннях компонентів мг/л: абсцизова кислота - 0,5; дріжджовий екстракт 100. Використання даного способу прискореного отримання калюсної маси та модифікованого регенераційного середовища дозволяє у більш Таблиця 2 короткий термін та в більшій кількості отримувати резистентні до комплексу стресових чинників Концентрація компонентів поживного середовища, мг/л цукрових буряків рослини-регенеранти для використання їх в селекції на стійкість до абіотичних стресів і таким чином забезпечити Середовище 1, РВ-10 Середовище2, РВ-21 Компоненти скорочення і спрощення біотехнологічного процесу (прототип) (заявлене) та зменшити матеріальні затрати для його Амоній азотнокислий 1650,0 1650,0 виконання.1900,0 Калій азотнокислий 1900,0 Це стало можливим здійснити на основі даних, Кальцій хлористий 440,0 440,0 які були 370,0 одержані в результаті проведення Магній сірчанокислий 370,0 попередніх 170,0 досліджень. Як видно170,0 з таблиці 3 Калій фосфорнокислий, однозаміщений оптимальним для швидкого приросту біомаси Залізо сірчанокисле 27,95 27,95 резистентних калюсів є посадка у чашку Петрі Етилендіамінтетраацетат натрію 37,23 37,23 мікрокалюсів, діаметром 3мм на середовище ДСБорна кислота 6,2 6,2 8. Марганець сірчанокислий 22,3 22,3 Цинк сірчанокислий 8,6 8,6 Калій йодистий 0,83 0,83 Натрій молібденово кислий 0,25 0,25 Відносний приріст сирої маси у резистентних ліній цукрових буря Мідь сірчанокисла 0,025 0,025 середовища Кобальт хлористий 0,025 0,025 Р-амінобензойна кислота 0,2 Маса калюсу (мг) -Маса калюсу (мг) після 3 тижн Калюсна лінія культивування: Аскорбінова кислота 0,4 на момент посадки ДС-6 ДС-8 Д-біотин 0,00025 С-4х 0,2 2600 3200 5200 Холін-хлорид С-5х 0,5 2600 3060 5000 Ніацин С-11х 0,015 2600 3080 4900 Фолієва кислота С-12х 0,4 2600 3100 5000 Д-пантотенова кислота Піридоксин-НСl 0,5 При використанні спрощеного - живильного Тіамін-НСІ 0,5 середовища Фрейтага (РВ-21) відмічається Рібофлавін 0,015 збільшення 40,0 кількості регенеруючих 40,0 калюсів у 3-5 L-аргінін разів порівняно з прототипом, про що свідчать дані L-глютамін 60,0 60,0 наступної таблиці. L-аспарагін 40,0 40,0 L-гліцин 20,0 20,0 L-фенілаланін 20,0 20,0 L-триптофан 40,0 40,0 Частота регенерації у калюсних ліній цукрових буряків з комплекс Бензиламінопурин 0,40 0,80 Індолілмасляна кислота 0,1 - Кількість Кількість ка Абсцизова кислота 0,5 Калюсна лінія Середовище висаджених утворювали калюсів, шт регенер Дріжджовий екстракт 100,0 С-4х 2000 РВ-10 3 Хлорид натрію 2000 100 С-5х 30000,0 РВ-10 2 Сахароза 30000,0100 С-11х 8000,0 РВ-10 3 Агар-агар 8000,0 100 C-12x 1 літру PB-10 100 2 Бідистильована вода до до 1 літру C-4x PB-21 100 9 Новою, відмінною від прототипу ознакою, є C-5x PB-21 100 12 швидке нарощування маси резистентних калюсних C-11x PB-21 100 14 культур на модифікованому середовищі ДолліC-12x PB-21 100 15 Сандерса (ДС-8), яке додатково містить азотнокисле срібло та піклорам у таких Спосіб здійснюється наступним чином: на співвідношеннях компонентів: азотнокисле срібло агаризованому середовищі Доллі-Сандерса такого 10мг/л та піклорам - 1мг/л та прискорене складу: мг/л: амоній азотнокислий - 825,0; калій отримання рослин - регенерантів на спрощеному азотнокислий - 950,0; кальцій хлористий - 220,0; 7 магній сірчанокислий 185,0 калій фосфорнокислий, одно заміщений - 85,0; залізо сірчанокисле - 13,6; етилендіамінтетраацетат натрію - 18,7; борна кислота - 3,1; марганець сірчанокислий - 11,2 ; цинк сірчанокислий - 4,3; калій йодистий - 0,42; натрій молібденово кислий 0,13; мідь сірчанокисла - 0,013; кобальт хлористий - 0,013; мезоінозит - 100,0; гліцин - 2,0; тіамін-НСl 1,0; піридоксин НСl- 0,5; нікотинова кислота - 0,5; натрій хлор 2000,0 ; сахароза - 30000,0; агар-агар 9000,0; бідистильована вода - до 1 літру, відбирають резистентні до хлоридного засолення калюсні лінії. Проводять загартування дослідного матеріалу в 2-х режимах: 7 діб при +2°С і 14 діб з послідовною в тижневий інтервал зміною температур - +6°С і +2°С і обробку загартованих калюсів температурою -2°С протягом 6 годин. Потім добирають культури, які характеризуються нормальним ростом при температурі +2°С. Готують живильне середовище ДС-8 для швидкого нарощування біомаси наступного складу - мг/л: амоній азотнокислий - 825,0; калій азотнокислий - 950,0; кальцій хлористий - 220,0; магній сірчанокислий 185,0 калій фосфорнокислий, одно заміщений - 85,0; залізо сірчанокисле - 13,6; етилендіамінтетраацетат натрію - 18,7; борна кислота - 3,1; марганець сірчанокислий - 11,2 ; цинк сірчанокислий - 4,3; калій йодистий - 0,42; натрій молібденово кислий 0,13; мідь сірчанокисла - 0,013; кобальт хлористий -0,013; мезоінозит - 100,0; гліцин - 2,0; тіамін-НСl 1,0; піридоксин НСl - 0,5; нікотинова кислота - 0,5; азотнокисле срібло - 10,0; піклорам - 1,0; натрій хлор - 2000,0; сахароза - 30000,0; агар-агар 8000,0; бідистильована вода - до 1 літру. Поживне середовище (рН-5,95) розливають у мірні колби та автоклавують при температурі 120°С протягом 20хв (тиск 1,05атм). В стерильні чашки Петрі діаметром 80мм розливають по 30мл середовища. На кожну чашку висаджують по 30 штук калюсних агрегатів, діаметром 3мм. Матеріал культивують при температурі 24±2°С, освітленні 3-4клк протягом 20 діб. Через 20 діб нарощену біомасу для індукції органогенезу переносять на регенераційне середовище РВ-21 такого складу мг/л: амоній азотнокислий - 1650,0; калій азотнокислий 1900,0; кальцій хлористий - 440,0; магній сірчанокислий - 370,0; калій фосфорнокислий, одно заміщений - 170,0; залізо сірчанокисле 27,95; етилендіамінтетраацетат натрію - 37,23; борна кислота - 6,2; марганець сірчанокислий 22,3; цинк сірчанокислий - 8,6; калій йодистий 0,83; натрій молібденово кислий - 0,25; мідь сірчанокисла - 0,025; кобальт хлористий - 0,025; Lаргінін - 40,0; L-аспарагін - 40,0; L-гліцин - 20,0; Lглютамін - 60,0; L-фенілаланін -20,0; L-триптофан 40,0; бензиламінопурин - 0,8; хлорид натрію 2000; абсцизова кислота - 0,5; дріжджовий екстракт - 100,0; сахароза - 30000,0; агар-агар 8000,0; бідистильована вода - до 1л. Поживне середовище (рН-5,8) розливають у мірні колби та автоклавують при температурі 120°С протягом 20 хвилин (тиск 1,05атм). 30370 8 Дріджовий екстракт готують з живої культури пекарських дріжджів Saccharomyces cerevisiae, культивованих на картопляно-декстрозному агарі. Виділяють живу масу дріжджів, висушують у сушильній шафі при температурі 60°С до сухого стану. Готують водний розчин з розрахунку 1г сухих дріжджів на 100мл дистильованої води. Потім центрифугують та фільтрують через бактеріальний фільтр (розмір пор до 1,2мкм). Готують концентрат шляхом випаровування на роторному випарювачі при 45°С в 100 разів. Концентрат зберігають в холодильнику при температурі -5°С. В стерильні чашки Петрі діаметром 80мм розливають по 30мл регенераційного середовища. На кожну чашку висаджують оптимальну кількість калюсної маси, яка становить 20 штук агрегатів, діаметром до 3-5мм на відстані 8-10мм один від одного. Матеріал культивують при температурі 24±2°С, освітленні 3-4клк протягом пасажу до появи нормально розвинутих мікророзеток. Отримані рослини - регенеранти переносять на середовище для укорінення. Порівняльний аналіз заявленого винаходу з прототипом показав, що заявлений спосіб відрізняється новими суттєвими ознаками, які полягають в тому, що для швидкого нарощування біомаси використовують пересадку резистентних калюсів на модифіковане середовища ДС-8, яке додатково містить AgNO3 - 10мг/л та піклорам (4аміно-3,5,6-трихлорпіколінова кислота) - 1мг/л та прискорене отримання рослин - регенерантів на спрощеному середовищі РВ-21, у якому збільшена у 2 рази кількість 6-бензиламінопурину, вилучені всі вітаміни та індолилмасляна кислота та додатково введені абсцизова кислота та дріжджовий екстракт у таких співвідношеннях компонентів мг/л: абсцизова кислота - 0,5; дріжджовий екстракт - 100. Сукупність заявлених ознак прискорює процес отримання резистентних до комплексу абіотичних стресових чинників рослин - регенерантів у 4 рази та збільшує їх кількість у 3-5 разів і таким чином забезпечує скорочення біотехнологічного процесу і зменшення матеріальних затрат для його виконання. Заявлений спосіб підвищення регенераційної здатності калюсних культур цукрових буряків з комплексною стійкістю до абіотичних стресових чинників шляхом використання модифікованих поживних середовищ дозволяє прискорити процес отримання толерантних рослин-регенерантів та збільшити їх кількість, чим і обумовлена ефективність його застосування. Використання заявлених ознак забезпечує скорочення біотехнологічного процесу і зменшення матеріальних затрат для його виконання. Може бути використаний для одержання резистентних рослин-регенерантів в біотехнології та селекції цукрових буряків.