Спосіб підвищення гормональної активності органотипових культур щитовидних залоз новонароджених поросят

Спосіб підвищення гормональної активності органотипових культур щитовидних залоз новонароджених поросят, що включає культивування фрагментів щитовидних залоз в середовищі 199, збагаченому 10% сироватки великої рогатої худоби та йодидом калію, який відрізняється тим, що додатково на 3 добу культивування в середовище культивування вводять фрагменти надниркових залоз або гіпофізу. (19) (21) u200905844 (22) 09.06.2009 (24) 25.12.2009 (46) 25.12.2009, Бюл.№ 24, 2009 р. (72) БІЛЯВСЬКА СВІТЛАНА БОРИСІВНА, БОЖОК ГАЛИНА АНАТОЛІЇВНА, ЛЕГАЧ ЄВГЕН ІВАНОВИЧ, БОНДАРЕНКО ТЕТЯНА ПЕТРІВНА (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 31,24±0,9нмоль/мг білку на 2 добу до 28,81±2,1нмоль/мг білку на 4 добу культивування, що складає 7,7%. Крім того, на 4 добу спостерігається зниження життєздатності клітин в культурі до 52,68±0,7%. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб підвищення гормональної активності щитовидних залоз новонароджених поросят, в якому би, шляхом введення в середовище культивування додаткового модифікуючого агенту, забезпечувалась можливість підвищення показників гормональної активності. Ця задача вирішується тим, що в способі підвищення гормональної активності щитовидних залоз новонароджених поросят, який включає культивування фрагментів щитовидних залоз в середовищі 199, збагаченому 10% сироватки великої рогатої худоби та йодидом калію, згідно з корисною моделлю, додатково на 3 добу культивування в середовище культивування вводять фрагменти надниркових залоз або гіпофізу. Комбіноване культивування щитовидних залоз з наднирковими залозами або гіпофізом має позитивний вплив на морфофункціональні характеристики тканини щитовидної залози. Шляхи реалізації даного ефекту обумовлені локальною модифікуючою дією біологічно активних речовин на сигнально-регуляторні і трофічні процеси в тириоїдній тканині. Комбіноване культивування фрагментів щитовидних і надниркових залоз забезпечує підвищення гормональної активності на 89,5% порівняно з прототипом та життєздатності клітин на 19,5%. Комбіноване культивування фрагментів щитовидних залоз і гіпофізу забезпечує підвищення гормональної активності на 87,9% порівняно з прототипом та життєздатності клітин на 18,1%. Культивування фрагментів щитовидних залоз з фрагментами надниркових залоз або гіпофізу за заявленим способом може використовуватися на етапі обробки трансплантаційного матеріалу, а отримані таким чином гормонально активні культури щитовидних залоз призначені для трансплантації у випадку первинного гіпотиреозу лабільного перебігу, в стадії декомпенсації, при неефективності терапії синтетичними гормональними монопрепаратами. Спосіб здійснюють таким чином. Щитовидні, надниркові залози і гіпофізи експлантують від новонароджених поросят в асепти3 чних умовах, подрібнюють на фрагменти 0,5-1мм і переносять до культуральних флаконів із розрахунку 1 залоза на флакон. Фрагменти щитовидних залоз культивують протягом 3 діб на живильному середовищі 199, збагаченому 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби і йодидом калію (75мкг/л) з додаванням пеніциліну (100ОД/мл) і стрептоміцину (100мкг/мл) при температурі 37°С, з заміною середовища культивування 1 раз на добу. Потім на 3 добу культивування, до фрагментів щитовидних залоз вводять фрагменти надниркових залоз або гіпофізу, відокремлюють напівпроникливою мембраною та інкубують 24 години з заміною середовища на кожну добу культивування. 46440 4 Приклад 1. Щитовидні, надниркові залози і гіпофізи новонароджених поросят отримували в стерильних умовах і подрібнювали на фрагменти 0,5-1мм. Фрагменти щитовидних залоз культивували протягом 3 діб на живильному середовищі 199, збагаченому 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби і йодидом калію (75мкг/л) з додаванням пеніциліну (100ОД/мл) і стрептоміцину (100мкг/мл) при температурі 37°С. Заміну середовища культивування здійснювали 1 раз на добу. На 3 добу культивування фрагменти щитовидних залоз відокремлювали напівпроникливою мембраною від фрагментів надниркових залоз або гіпофізу і інкубували 24 години. Монокультури щитовидних залоз отримували шляхом культивування протягом 4 діб у вищеописаних умовах без внесення модифікуючих агентів. Для визначення здатності органотипових культур щитовидних залоз відповідати на дію модифікаторів гормонопоезу, на 3 добу в середовище культивування монокультур щитовидних залоз або комбінованих культур щитовидних і надниркових залоз додавали дибутирил-циклічний аденозинмонофосфат (1ммоль/мл) на 12 годин, а комбіновані культури щитовидних залоз і гіпофізу інкубували в присутності тиротропін-рилізинг гормону (200мкг/мл) протягом 2 годин. Гормональну активність органотипових культур щитовидних залоз визначали за вмістом тироксину в середовищі культивування. Концентрацію тироксину в середовищі культивування дослідних зразків визначали методом радіоімунологічного аналізу з використанням стандартних тест-наборів РІА-Т4-СТ (Білорусь) згідно з інструкцією. Показники вмісту Т4 нормували на білок, який вимірювали за методом Бредфорда. Життєздатність культур визначали на 4 добу культивування методом суправітального забарвлення трипановим синім клітинної суспензії, отриманої методом ферментативної дезагрегації. Кількість життєздатних клітин (ЖК, %) визначали шляхом підрахунку в гемоцитометрі і знаходили за формулою: ЖК=( незабарвл заг) 100, де незабарвл кількість живих (незабарвлених) клітин, заг - загальна кількість клітин в полі зору. Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента і однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) - для непараметричних даних. Дані, наведені в Табл. 1, свідчать, що вміст тироксину в середовищі культивування фрагментів щитовидних залоз новонароджених поросят на 4 добу дорівнював 36,29 1,7нмоль/мг білка, що на 74,6% вище за представлений в прототипі (9,23 0,7нмоль/мг білка). Рівень Т4 в інкубаційному середовищі після комбінованого культивування фрагментів щитовидних і надниркових залоз вірогідно збільшувався на 58,8% порівняно з монокультурою щитовидних залоз і складав 88,05 3,0нмоль/мг білка. Комбіноване культивування фрагментів щитовидних залоз і гіпофізу також супроводжувалось вірогідним збільшенням концентрації тироксину в середовище інкубації на 52,5%, яка дорівнювала 76,35 2,7нмоль/мг білка. Показник життєздатності клітин монокультур 5 46440 щитовидних залоз (Табл. 2) на 4 добу культивування складав 52,68 0,7%. Показник життєздатності клітин комбінованих культур щитовидних і надниркових залоз становив 68,25 0,02%, що на 19,5% вище ніж у клітин монокультур щитовидних залоз. Зафіксовано збільшення життєздатності клітин (64,36 0,01%) в органотипових культурах щитовидних залоз після комбінованого культивування з експлантатами гіпофізу на 18,1%. Приклад 2. Ефективність заявленого способу підвищення гормональної активності органотипових культур щитовидних залоз новонароджених поросят також оцінювали in vivo шляхом ксенотрансплантації тваринам з експериментальним гіпотиреозом. В якості тварин-реципієнтів використовували самок щурів вагою 165-215г. Післяопераційний гіпотиреоз моделювали за допомогою ретроградної тиреоїдектомії під комбінованим внутрішньочеревним наркозом (кетамін 2,5мг, ксилазин - 0,5мг/100г маси тіла). З метою запобігання порушення кальцієвого обміну тваринам давали 0,2% розчин кальцію хлориду. Контролем були інтактні щури. Органотипові культури щитовидних і надниркових залоз отримували за методом, описаним в 6 Прикладі 1. Трансплантаційний матеріал у дозі 3035мг вносили під капсулу нирки, перед цим тваринам здійснювали лівосторонню адреналектомію методом електрокоагуляції. Тварин виводили із експерименту на 30 добу після трансплантації. Вміст загального тироксину в плазмі крові тварин-реципієнтів визначали за допомогою радіоімунологічного аналізу з використанням тест-наборів РІА-Т4-СТ (Білорусь) згідно з інструкцією. Після трансплантації органотипових культур щитовидних залоз гіпотиреоїдним щурам (Табл. 3) рівень загального Т4 складав 24,03 5,4нмоль/л, що на 61,1% менше в порівнянні з інтактним контролем (61,71 6,1нмоль/л) та на 24,0% більше порівняно з тиреоїдектомованими тваринами (18,26 0,8нмоль/л). Комбіноване культивування фрагментів щитовидних залоз з фрагментами надниркових залоз зумовило підвищення рівня тироксину в плазмі крові тварин-реципієнтів після ксенотрансплантації (29,48 0,6нмоль/л) в порівнянні з ксенотрансплантацією монокультур щитовидних залоз (24,03 5,4нмоль/л). Таблиця 1 Рівні базальної та стимульованої секреції тироксину (нмоль/мг білка) органотиповою культурою щитовидної залози новонароджених поросят в інкубаційному середовищі на 4 добу культивування (М±m, n=28) Комбінована oрганотипова Комбінована oрганотипова культура щитовидної і над- культура щитовидної залози і ниркової залози гіпофізу базальна сек- стимульована базальна сек- стимульована базальна сек- стимульована реція секреція реція секреція реція секреція Органотипова культура щитовидної залози Запропонований спосіб Спосіб за прототипом 36,29 1,7 92,44 4,5* 88,05 3,0* 50,09 6,2 76,35 2,7* 46,22 3,6 9,23 0,7 28,81 2,1 * -р