Спосіб кріоконсервування органної культури щитоподібної залози новонароджених поросят

Спосіб кріоконсервування органної культури щитоподібної залози новонароджених поросят, який включає інкубацію в кріоконсервуючому розчині, що містить середовище 199 і кріопротектор 7% димексид, заморожування до -196°С, зберігання у рідкому азоті та відігріванні, який відрізняється тим, що інкубацію органної культури проводять при 22°С протягом ЗО хвилин, а заморожування здійснюють над дзеркалом рідкого азоту зі швидкістю 85-100°С/хв. протягом 3 хвилин з подальшим зануренням у рідкий азот. Корисна модель належить до кріобіології і кріомедицини і може бути використаний у трансплантологи. Відомий спосіб кріоконсервування шматочків щитоподібної залози в кріоконсервуючому розчині, що містить живильне середовище, 10% ембріональну телячу сироватку та 10% диметилсульфоксид (димексид), в умовах преінкубації на протязі 1 години при 4°С, заморожування з повільною швидкістю охолодження до -80°С та занурення у рідкий азот[1]. Недоліком цього способу є те, що після відігрівання життєздатність клітин складає лише 45,5% від нативного контролю. Найбільш близьким до заявленого способу за своєю суттю та ефектом, що досягається, є спосіб кріоконсервування органної культури щитоподібної залози новонароджених поросят, що включає інкубацію по 15хв при 4°С та при 37°С в кріоконсервуючому розчині, який містить живильне середовище 199 та 7% димексид, заморожування зі швидкістю 10°С/хв до -70°С та занурення у рідкий азот. Відігрівання здійснюють на водяній бані при 37°С до появи рідкої фази, після чого відмивають середовищем 199 для видалення кріопротектору [2]. Недоліком цього способу є те, що він знижує рівень секреції тироксину клітинами органної культури на 75% у першу добу та на 38% у другу добу після розморожування в порівнянні з інтактною тканиною [3]. Це зумовлено тим, що двоетапна інкубація органної культури з димексидом у різних температурних режимах (15хв при 4°С та 15хв при 37°С) призводить до небажаних флуктуацій параметрів його накопичування у клітинах за рахунок змінення текучості їх мембран. При цьому, підвищення температури до 37°С на другому етапі призводить до зростання швидкості накопичування димексиду і прояву його токсичного впливу на загальний клітинний метаболізм шляхом пригнічення активності аденілатциклази та зменшення чутливості клітин до специфічних регуляторів гормонопоезу [4], а також змінення параметрів йодування тиреоглобуліну [5]. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування органної культури щитоподібної залози, в якому змінення режиму інкубації та заморожування дозволило би підвищити секрецію тироксину. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування органної культури щитоподібні залози, який включає інкубацію в кріоконсервуючому розчині, що містить середовище 199 і кріопротектор 7% димексид, заморожування до -196°С, зберігання у рідкому азоті та відігрівання, згідно з, корисною моделлю, інкубацію органної культури проводять при 22°С протягом ЗО хвилин, а заморожування здійснюють над дзеркалом рідкого азоту зі швидкістю 85-100°С/хв протягом 3 хвилин з подальшим зануренням у рідкий азот. Змінення режиму інкубації в кріоконсервуючому розчині та швидкості заморожування дозволяють зберегти гормональну активність органної культури щитоподібної залози на рівні 95,6% в порівнянні з нативними зразками, що дорівнює 33,6% приросту гормональної активності кріокон CO О 9367 сервованого матеріалу в порівнянні з прототипом. Крім того, запропонований спосіб потребує менше часу для здійснення і тому є більш економічним. Спосіб здійснюється таким чином. Органну культуру щитоподібної залози новонароджених поросят відмивають від середовища культивування. Переносять 0,5мл культури у пластикові контейнери для кріоконсервування об'ємом 2мл. До органної культури додають 0,5мл кріоконсервуючого розчину, що містить живильне середовище 199 та 14% димексиду. В кріоконсервуючому розчині органну культуру інкубують протягом ЗО хвилин при температурі 22°С, після чого заморожують над дзеркалом рідкого азоту протягом З хвилин зі швидкістю 85-100°С/хв, після чого занурюють у рідкий азот (-196°С). Приклад 1. Органну культуру, отриману з однієї щитоподібної залози новонародженого порося, культивували протягом 3 діб у 2мл живильного середовища 199 з додаванням 10% теплоінактивованої сироватки великої рогатої худоби, 100Од/мл пеніциліну, 75мкг/мл канаміцину та 75мкг/л йодиду калію за методом [6]. Після 3 доби культивування органну культуру відмивали від середовища культивування. Переносили 0,5мл культури у пластикові контейнери для кріоконсервування об'ємом 2мл. До органної культури додавали 0,5мл кріоконсервуючого розчину, що містив живильне середовище 199 та 14% димексиду. Інкубацію здійснювали у 4 різних режимах: 1)15хвпри4°С; 2) 15хв при 4°С та 15хв при 37°С; 3) 15хвпри22°С; 4) ЗОхв при 22°С. Заморожування здійснювали над дзеркалом рідкого азоту протягом 3 хвилин, що забезпечувало зниження температури у зразках зі швидкістю 85-100°С/хв. Після цього зразки були занурені у рідкий азот, де і зберігалися до наступного етапу експерименту протягом 72 годин. Відігрівання здійснювали на водяній бані при 37°С до появи рідкої фази. Видаляли димексид шляхом 3-х разового відмивання у Юмл живильного середовища 199. Секрецію тироксину клітинами органної культури щитоподібної залози оцінювали на другу добу після розморожування. Для цього розморожену органну культуру після видалення кріопротектору приміщали у 2мл живильного середовища 199, що містило 10% теплоінактивованої сироватки великої рогатої худоби, 100Од/мл пеніциліну, 75мкг/мл канаміцину та 75мкг/л йодиду калію. Після першої доби живильне середовище змінювали на свіже. Після другої доби відбирали пробу з живильного середовища та вимірювали рівень тироксину радіоімунологічним методом з використанням тест набору РІА-Т4-СТ (Беларусь). Кількість гормону розраховували на білок [7]. Контролем в цьому експерименті служила інтактна органна культура щитоподібної залози п'ятої доби культивування. Результати експерименту подані у таблиці 1. З даних таблиці 1 випливає, що найбільш близькими за параметром зберігання гормональної активності до контролю при запропонованій швидкості охолодження є режими інкубації в кріоконсервуючому розчині, в яких не використовується температура 37°С. Приклад 2. Органну культуру щитоподібної залози отримували та кріоконсервували як описано у прикладі 1. Після відігрівання та видалення кріопротектору шляхом 3-х разового відмивання у Юмл живильного середовища 199 в органній культурі було проаналізовано кількість життєздатних клітин за виключенням суправітального барвника трипанового синього. Для цього розморожену органну культуру приміщали у 2мл живильного середовища 199, що містило 10% теплоінактивованої сироватки великої рогатої худоби, 100Од/мл пеніциліну, 75мкг/мл канаміцину та 75мкг/л йодиду калію. Після першої доби живильне середовище змінювали на свіже. Після другої доби відбирали пробу культури для визначення життєздатності. Для отримання суспензії клітин фрагменти органної культури струшували протягом 15хв при 37°С у забуференому фізіологічному розчині, що містив 0,2мг/мл колагенази та 0,2% сироватки великої рогатої худоби. Після цього фрагменти були протерті крізь сітку з розміром комірок 125х125мкм. Отримана клітинна суспензія була двічі центрифугована при 3000об/хв (центрифуга ОПН-3) протягом Зхв у Юмл забуференого фізіологічного розчину. Клітинний осад було розведено у 0,2мл забуференого фізіологічного розчину. Для вимірювання життєздатності до 0,05мл клітинної суспензії додавали 0,010мл розчину трипанового синього з концентрацією 8мг/мл. Кількість клітин підраховували у камері Горяєва [8]. Результати експерименту подані у таблиці 2. Як видно з даних, що подані у таблиці 2, заморожування в режимі інкубації в кріоконсервуючому розчині протягом ЗОхв при температурі 22°С при запропонованої швидкості охолодження забезпечує зберігання життєздатними 97,22% клітин органної культури щитоподібної залози. Таким чином, на підставі поданих прикладів можна зробити висновок, що заявлений спосіб кріоконсервування органної культури щитоподібної залози новонароджених поросят забезпечує одержання кріоконсервованого матеріалу з життєздатністю та гормонсекретуючою активністю, що дорівнює контрольним значенням. Таблиця 1 Рівень тироксину в живильному середовищі на другу добу після кріоконсервування органної культури щитоподібної залози (п=10) Умови експерименту 1 Вміст тироксину нМоль/мг білку % від контролю 2 3 9367 Продовження таблиці 1 1 Контроль (інтактна 5-добова культура) Крюконсервована в режимі інкубації з крюпротектором 15хв при4°С Крюконсервована в режимі інкубації з крюпротектором 15хв при 4°С та 15хв при 37°С Крюконсервована в режимі інкубації з крюпротектором 15хв при 22°С Крюконсервована в режимі інкубації з крюпротектором ЗОхв при 22°С 2 30,47±4,36 3 29,78+3,81 97,7 24,76±2,11 81,2 32,48+5,15 100 29,15±1,01 95,6 Таблиця 2 Життєздатність клітин органної культури надниркових залоз до та після кріоконсервування та рекультивування (п=10) Умови експерименту Крюконсервована в режимі інкубації тором 15хв при 4°С Крюконсервована в режимі інкубації тором 15хв при 4°С та 15хв при 37°С Крюконсервована в режимі інкубації тором 15хв при 22°С Крюконсервована в режимі інкубації тором ЗОхв при 22°С Життєздатність, % від контролю з крюпротекз крюпротек 50,11 з крюпротек 79,90 з крюпротек Джерела інформації: 1. Kitamura Y., Shimizu К., Nagahama M., Shoji Т. Cryopreservation of thyroid pieces - optimal freezing condition and recovery // Nippon Geka Gakkai Zasshi. -1994. - V.95, №1. - P. 14-20. 2 Луговой СВ., Бондаренко Т.П., Турина Т.М., Глушко Т А Влияние режимов криоконсервирования на морфологические характеристики органной культуры щитовидной железы новорожденных поросят // Проблеми ендокринної патологи - 2003. -№3 -С.82-87. 3. Луговий С В . Вплив кріоконсервування на культуру клітин щитовидної залози новонароджених поросят // Автореф. дис. канд мед. наук. - Харків, 2003. -18с. 4 Karpenko L.G., Gubina N.F., Schirova V.A., Kaprelyants A.S The effect of freezing and cryoprotectant exposure on adenylate cyclase activity in cell membranes of bovine thyroid gland and adrenal cor Комп'ютерна верстка А Попік 60,92 97,22 adrenal corlex // CryoLetters. - 2001. - V.22, №4, P.229-234. 5 Туракулов Я.Х., Гуссаковский Е.Е , Исмаилов С И , Налбандян А.А Влияние криоконсервации тиреоидной паренхимы на йодаминокислотный состав тиреоглобулина и его йодирование // Пробл. эндокринологии - 1985. - Т.31, №1 - С.2931. 6 Тронько М.Д., Горбань Є М., Турчин И.С. та їй Вплив ксенотрансплантації органної культури щитоподібної залози на стан ппоталамоппофізарно-тиреоідної системи при експериментальному гіпотиреозі // Трансплантолопя - 2000. т.1,№1 -С.236-238. 7. Практическая химия белка: / Под ред. Дарбе А.; Пер.сангл - М. Мир, 1989. - С.297-298 8. Лимфоциты Методы / Под ред. Дж Клауса; Пер. с англ.- М . Мир, 1990 - 395с. Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601