Спосіб діагностики рака

Спосіб діагностики раку шляхом забору крові з ліктьової вени обстежуваного, виділення сироватки крові, визначення активності маркера раку, який відрізняється тим, що як маркер раку використовують катаболічну тимідинфосфорилазу (ТФ), и активність визначають таким чином експериментальну та контрольну пробірки заповнюють тимідином, калій - фосфатним буфером та розчиненою у фізіологічному розчині в 10 разів сироваткою у співвідношенні 1 3 1,5 ВІДПОВІДНО, причому в контрольну пробірку сироватку додають Винахід належить до області медицини, зокрема до практичної медицини, та може бути використаним для ранньої діагностики рака різноманітної локалізації при скринінгових профілактичних дослідженнях, при періодичних обстеженнях груп підвищеного ризику щодо розвитку злоякісних пухлинних процесів Відомо спосіб діагностики рака [1] шляхом забору крові з ліктьової вени обслідуємого, виділення сироватки крові, визначення активності маркера рака При цьому в якості маркера рака використовують теломеразу, и активність визначають по методиці TRAP (telomerase repeat amplification protocol), що використовує активність теломерази та полімеразну ланцюгову реакцію Недоліком способу є його висока вартість, бо реалізація способу потребує спеціальної апаратури, наборів реактивів, а також тривалість виконання тому, що протокол TRAP - тривалий процес, який використовує активність теломерази та полімеразну ланцюгову реакцію Враховуючи складні умови для проведення протоколу, широке впровадження способу в практику профілактичних обстежень неможливе після інкубації пробірок ЗО хвилин при 37°С, зупиняють реакції в пробірках, осаджують білок, в надосадовій рідині по оптичній ЩІЛЬНОСТІ виміряють екстинцію, визначають вміст білка в сироватці крові обстежуваного по методу Лоурі, по формулі розраховують активність катаболічної ТФ АТФ = Де АТФ - активність катаболічної ТФ, ЕЕКСП - екстинція в експериментальній пробірці, Е« - екстинція в контрольній пробірці, ЕМАКС - максимальна екстинція тимідину, Б - вміст білку в сироватці крові (мг/мл), 10 - розведення сироватки, потім розраховують відношення активності ТФ в сироватці крові відповідної здорової вікової групи з активністю ТФ обстежуваного та при зниженні активності в 2,7 - 3,3 рази діагнозують рак Найбільш близьким по технічній суті вирішуваної задачі є спосіб діагностики рака [2] шляхом забору крові з ліктьової вени обслідуємого, виділення сироватки крові, визначення активності маркера рака При цьому в якості маркера рака використовують тимідинкіназу (ТК), и активність визначають у спеціалізованій для роботи з радіоактивними ізотопами лабораторії Для цього в 4 пробірки вносять радіоактивний С 14 тимідин, трисHCL буфер, розчинену сироватку та АТФ, МдСЬ, NaF Проби шкубують при 37°С по 10, 20, ЗО, 40 хвилин ВІДПОВІДНО Зупиняють реакції, осаджують білок Наносять аліквоти по Юмкл надосадової рідини на целюлозні диски ДЕАЕ Диски занурюють на 10 хвилин в форміатний буфер та на 5 хвилин в воду, цю процедуру повторюють ДВІЧІ Оброблені таким чином диски висушують при 60°С Радіоактивність дисків підраховують у СЦИНТИЛЯЦІЙНІМ лічильнику По формулі розраховують активність ТК у перерахунку на білок сироватки крові, який визначають по методу Лоурі [3] Недоліком відомого способу є те, що для його проведення потрібні спеціальні умови - спеціалізована для роботи з радіоактивними ізотопами ла О ю ю 00 48550 бораторія На її обладнання потрібні значні витрати Спосіб багато коштує ще й тому, що використовуються дорогі реактиви та апаратура - радіоактивний тимідин та сцинтиляційний лічильник Проведення дослідження - тривалий, трудоемкий процес, що складається з проведення серії реакцій тривалістю 10, 20, ЗО, 40 хвилин ВІДПОВІДНО, ЩО заважає проводити одночасно декілька досліджень Процес фіксації дисків складається з чотирьох етапів, загальна тривалість яких складає 2 години Реалізація способу здійснюється за 3,5 години Таким чином, визначення активності ТК тривалий, трудоемкий, багатокоштовний спосіб, який не може бути використаним для ранньої діагностики рака різноманітної локалізації при скринінгових профілактичних дослідженнях та при періодичних обстеженнях груп підвищеного ризику щодо розвитку злоякісних пухлинних процесів В основу винаходу поставлено завдання розробити спосіб діагностики рака шляхом забору крові з ліктьової вени обслідуємого, виділення сироватки крові, визначення активності маркера рака, де в якості маркера рака використовують катаболічну тимідинфосфорилазу (ТФ), що конкурує з тимідинкіназою за субстрат (тимідин), для цього визначають активність ТФ та розраховують відношення активності ТФ в сироватці крові відповідної здорової вікової групи з активністю ТФ обслідуємого, та при зниженні активності в 2,7 - 3,3 рази діагнозують рак, що дає можливість спростити спосіб та значно знизити його вартість Суть способу полягає в тому, що діагностику рака здійснюють шляхом забору крові з ліктьової вени обслідуємого, виділення сироватки крові, визначення активності маркера рака - ТФ и активність визначають таким чином експериментальну пробірку заповнюють тимідином, калій-фосфатним буфером та розчиненою у фізіологічному розчині в 10 разів сироваткою крові у співвідношенні 1 3 1,5 ВІДПОВІДНО У контрольну пробірку помішують тимідин та калій - фосфатний буфер у ВІДПОВІДНІМ співвідношенні Пробірки шкубують при 37°С на протязі ЗО хвилин Одразу після інкубації у контрольну пробірку додають розчинену у 10 разів у фізіологічному розчині сироватку крові та зупиняють реакції в пробірках, осаджують білок, в надосадовій рідині по оптичній ЩІЛЬНОСТІ виміряють екстинцію, вміст білку в сироватці крові обслідуємого визначають по методу Лоурі [3] По формулі розраховують активність катаболічної ТФ АТФ - активність катаболічної ТФ, ЕЕКСП - екстинція в експериментальній пробірці, Е« - екстинція в контрольній пробірці, ЕМАКС - максимальна екстинція тимідина, Б - вміст білка в сироватці крові (мг/ мл), 10 - розведення сироватки Розраховують відношення активності катаболічної ТФ в сироватці крові відповідної здорової вікової групи з активністю ТФ обслідуємого та при зниженні активності в 2,7 - 3,3 рази діагнозують рак Новим в способі, що заявляється, є те, що в якості маркера рака використовують катаболічну ТФ її активність визначають таким чином експериментальну та контрольну пробірки заповнюють тимідином, калій-фосфатним буфером та розчиненою у фізіологічному розчині в 10 разів сироваткою крові у співвідношенні 1 3 1,5 ВІДПОВІДНО, причому у контрольну пробірку сироватку додають одразу після інкубації пробірок при 37°С на протязі ЗО хвилин Зупиняють реакції в пробірках, осаджують білок, в надосадовій рідині по оптичній ЩІЛЬНОСТІ виміряють екстинцію Вміст білку в сироватці крові обслідуємого визначають по методу Лоурі [3] По формулі розраховують активність катаболічної ТФ А т ф = д ЕМАКС х Б АТФ - активність катаболічної ТФ, ЕЕКСП - екстинція в експериментальній пробірці, Е« - екстинція в контрольній пробірці, ЕМАКС - максимальна екстинція тимідина, Б - вміст білка в сироватці крові (мг/ мл), 10 - розведення сироватки Розраховують відношення активності катаболічної ТФ в сироватці крові відповідної здорової вікової групи з активністю ТФ обследуемого та при зниженні активності в 2,7 - 3,3 рази діагнозують рак Розробка способу, що заявляється, стала можливою завдяки встановленому авторами науковому факту, що сироватка крові відображає особливості проліферативних процесів у тканинах [4] Катаболічна ТФ розщеплює тимідин до тиміна, т ч знижує можливість використання тимідина у синтезі ДНК, каталізуєме тимідинкіназою [5] В результаті дослідження активності ТК та ТФ у сироватці крові при раці різноманітної локалізації (рак шлунка, рак кишечника, рак молочної залози) встановлена чітка кореляція між активністю ТК та ТФ [2, 4, 5] Збільшення активності ТК, що є характерним для рака [6], супроводжується зниженням активності катаболічної ТФ Згідно попереднім дослідженням авторів, активність ТФ залежить від віку За показниками активності ТФ в сироватці крові здорових людей різного віку, їх об'єднано у ВІКОВІ групи [7] Встановлено достовірне зниження активності ТФ у хворих раком шлунка, мінімальна активність спостерігається у ВІЦІ 46 - 60 років У жінок хворих раком молочної залози мінімальна активність ТФ (в 3 рази нижче норми) спостерігається після 60 років Вказане співвідношення тимідина, калійфосфатного буфера та розчиненої в 10 разів у фізіологічному розчині сироватки є оптимальним для роботи катаболічної ТФ, причому максимальну активність катаболічна ТФ виявляє на ЗО хвилині інкубації Контрольну пробірку використовують для визначення екстинцм продукту реакції, коли знаходять різницю між екстинціями експериментальної та контрольної пробірок Активність ТФ виражали в умовних одиницях За одиницю ферментативної активності приймали збільшення екстинцм тиміна при ЗООнм на мг білку на протязі ЗО хвилин інкубації Спосіб, що заявляється, має добре відтворення та схожість результатів в паралельних дослідженнях та є високочуттєвим, що дає можливість діагнозувати рак різноманітної локалізації на ранніх стадіях Реалізують спосіб діагностики рака таким чином 3 ліктьової вени обслідуємого шприцем набирають 0,5мл крові в пробірку, центрифугують 5 48550 хвилин при 3000 оборотів на хвилину та виділяють сироватку крові Експериментальну пробірку заповнюють тимідином, калій-фосфатним буфером та розчиненою у фізіологічному розчині в 10 разів сироваткою крові у співвідношенні 1 3 1,5 ВІДПОВІДНО У контрольну пробірку помішують тимідин та калій-фосфатний буфер у ВІДПОВІДНІМ співвідношенні Обидві пробірки інкубують при 37°С на протязі ЗО хвилин Одразу після інкубації у контрольну пробірку додають розчинену у 10 разів у фізіологічному розчині сироватку крові Зупиняють реакції в пробірках, занурюючи їх на 2 хвилини в киплячу водяну баню та охолоджуючи на льоді 2 хвилини Осаджують білок за допомогою 0,01 н розчина NaOH, доводячи об'єм проб до Змл, та центрифугуючи обидві пробірки при 3000 оборотів на хвилину на протязі 15 хвилин В надосадовій рідині по оптичній ЩІЛЬНОСТІ на спектрофотометрі СФ-46 при ЗООнм виміряють екстинцію в пробірках Паралельно визначають вміст білку в сироватці крові обслідуємого по методу Лоурі [3] По формулі розраховують активність катаболічної ТФ АТФ - активність катаболічної ТФ, ЕЕКСП - екстинція в експериментальній пробірці, Ек - екстинція в контрольній пробірці, ЕМАКС - максимальна екстинція тимідина, Б - вміст білка в сироватці крові (мг/ мл), 10 - розведення сироватки Розраховують відношення активності катаболічної ТФ в сироватці крові відповідної здорової вікової групи з активністю ТФ обслідуємого та при зниженні активності в 2,7 - 3,3 рази діагнозують рак Спосіб реалізують за 1,5 години Конкретні приклади реалізації заявляемого способу діагностики рака Приклад 1 Хвора 3 , 48 років КЛІНІЧНИЙ діагноз виразкова хвороба, активна фаза, виразка дванадцятипалої кишки, виразка шлунка, ускладнена кровотечею середнього ступеня важкості За даними фіброгастродуоденоскопм (ФГДС) виразка шлунка до 6см, з щільними, нерівними краями, що потребує морфологічної оцінки На задній СТІНЦІ дванадцятипалої кишки виразка до 5мм, з рівними краями, вкрита фібрином У хворої з ліктьової вени набрано кров Виділяють сироватку В експериментальну пробірку у співвідношенні 1 3 1,5 помішують тимідин, калій-фосфатний буфер та розчинену у фізіологічному розчині в 10 разів сироватку крові У контрольну - тільки тимідин та калійфосфатний буфер Після інкубації пробірок при 37° С на протязі ЗО хвилин у контрольну пробірку додають розчинену у 10 разів у фізіологічному розчині сироватку крові Обидві пробірки занурюють на 2 хвилини в киплячу водяну баню, а потім в штативі ставлять на лід на 2 хвилини Загальний об'єм проб в пробірках доводять 0,01 н розчином NaOH до Змл Центрифугують при 3000 оборотів на хвилину на протязі 15 хвилин В надосадовій рідині виміряють екстинцію в експериментальній та контрольній пробірках екстинція в експериментальній пробірці - ЕЕКСП = 0,379, в контрольній - Ек = 0,368 По методу Лоурі визначають вміст білку в сироватці крові Б = 64Г/Л По формулі розраховують активність катаболічної ТФ АТФ = 0,0372 ум од В результаті дослідження встановлено еталонну активність ТФ в здорових вікових групах В здоровій ВІКОВІЙ групі активність катаболічної ТФ в сироватці крові дорівнює 0,3600 ± 0,02 ум од Розраховують відношення 0,3600 0,0372 = 9,83 Таким чином, у хворої 3 активність катаболічної ТФ знижена в 9,8 рази, що дає можливість діагнозувати рак Хворій 3 було зроблено резедцію шлунку Згідно З ГІСТОЛОГІЧНИМ дослідженням було встановлено діагноз недиференційований поліморфноклітинний рак шлунку Приклад 2 Хвора X , 46 років КЛІНІЧНИЙ діагноз фіброзно-кістозна мастопатія правої молочної залози Захворювання молочної залози? Аналогічно, як і у хворої 3 , 48 років, проводять дослідження активності катаболічної ТФ у сироватці крові У хворої X ЕЕКСП = 0,4297, Е к = 0,3581 Вміст білку в сироватці крові Б = 73Г/Л По формулі розраховують активність катаболічної ТФ АТФ - 0,2338 ум од Відношення активності ТФ здорової вікової групи до активності ТФ хворої X дорівнює 0,3600 0,2338 = 1 , 6 Встановлено зниження активності катаболічної ТФ в 1,6 рази, що вказує на доброякісний характер новоутворення правої молочної залози Хворій X виконано секторальну резекцію правої молочної залози Гістологічне дослідження підтвердило діагноз фіброзно-кістозної мастопатії Приклад 3 Хворий С , 53 роки КЛІНІЧНИЙ діагноз бластома шлунку? ФГДС поверхневий рефлюкс - гастрит Гіперемія слизової оболонки середньої треті тіла Виражений дуоденіт Цибуля дванадцятипалої кишки зменшена в об'ємі, позитивний симптом "манної крупи" Аналогічно, як у попередніх прикладах, у хворого С у перший день перебування у лікарні беруть кров з ліктьової вени, виділяють сироватку крові Проводять реакцію В надосадовій рідині виміряють екстинцм ЕЕКСП = 0,559, Ек = 0,551 По методу Лоурі визначають вміст білку в сироватці крові Б = 70г/л Відношення активності ТФ здорової вікової групи до активності ТФ хворого С дорівнює 0,4700 0,03=15,7 Активність катаболічної ТФ хворого С знижена в 15,7 рази, що дозволяє діагнозувати рак Хворого було дообслідовано Згідно з даними ультразвукового дослідження органів черевної порожнини у хворого С діагнозовано рак підшлункової залози Лабораторні випробування способа, що заявляється, проведені на 52 хворих та 85 здорових людях Перевагою способу, що заявляється є те, що він простий у виконанні, не потребує спеціальних умов для проведення Нерадюактивний тимідин, що використовується в якості субстрата в пробах, має малу коштовність Спектрофотометр СФ-46 є стандартним обладнанням КЛІНІЧНИХ лабораторій Реалізація способу здійснюється за 1 годину Одночасно може бути проведено до десяти досліджень Все це робить перспективним вживання способу в практичній медицині для ранньої діагностики рака різноманітної локалізації при скринінгових профілактичних дослідженнях, при періодичних обстеженнях груп підвищеного ризику щодо розвитку злоякісних пухлинних процесів Література 1 Раков А Л , Бокарев И Н , Резван В В Тело 48550 мераза - новые диагностические и лечебные возможности в онкологии // Военно-медицинский журнал — 2000 — № 11 — С 26-29 2 Борзенко Б Г , Думанский Ю Я , Сорока В Р Тимидинкиназа сыворотки крови как тест в диагностике рака желудочно-кишечного тракта // Информационный листок о научно-техническом достижении № 90 - 255 — Информация № 25 РЦНМИ МЗ УССР — 1990 3 Lowry О Н , Rosenbroug N L, Farr A Z , Randall В J//J Biol Chem —1951 —V 193, №1 — р 265-267 4 Борзенко Б Г , Помазан В О , Горбачев А А и др Возрастные особенности метаболизма предшественников ДНК у больных мастопатией // Вопросы медицинской химии — 1997 — Т 43, 8 вып4 — С 267-271 5 Борзенко Б Г , Бакурова Е М , Ватутин Н Т Два изоферментньїх спектра тимидинфосфорилазы и их участие в метаболизме ДНК // Архив клинической и экспериментальной медицины — 2000 —Т 9, № 3 — С 407-412 6 O'Neil K L , Gngsby R V , Fairbairn D W Thymidine kmase the future in breast cancer progno sis // The Breast — 1995 — Vol 4, № 2 — P 79 83 7 Борзенко Б Г , Горбачев А А , Думанский Ю В и др Активность ферментов метаболизма ДНК в сыворотке крови больных раком молочной железы // Вопросы онкологии — 1990 — Т 36, № 1 — С 17-23 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71