Протипухлинна вакцина на основі міцелярного комплексу глікопептид -cpg-днк

Протипухлинна вакцина на основі міцелярного комплексу глікопептид – СрG-ДНК, яка відрізняється тим, що являє собою переважно міцелярний комплекс глікопептидної фракції з молекулярною масою 50 кДа, ізольованої з пухлинних клітин, яка містить пухлиноасоційовані антигени та CpG-ДНК бактеріального походження з неметильованим цитозином, отриману з культуральної рідини Bacillus subtilis GP1-807-03, яка є потужним природним ад'ювантом, що підсилює протипухлинний та антиметастатичний ефекти вакцини. Корисна модель стосується галузі медицини, зокрема - онкології, а саме - експериментальної онкології. Розроблена лабораторна технологія отримання глікопептидної вакцини в комплексі з бактеріальною ДНК певного складу, яка продемонструвала виражену протипухлинну та антиметастатичну дію при лікуванні перещеплюваної меланоми В-16 мишей. Найближчим аналогом даної корисної моделі є розроблена в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України протипухлинна автовакцина [1]. Суттєвою відмінністю між комплексною вакциною, що заявляється, та вакциною-найближчим аналогом є та обставина, що вакцина-найближчий аналог демонструє найкращу лікувальну дію за присутності ад'ювантів, які підсилюють її, тоді як сполука, описана далі в якості корисної моделі, містить в своєму складі вже вбудований ад'ювант-фрагмент молекули бактеріальної ДНК з неметильованими цитозиновими залишками. Стандартний штам меланоми В-16 був одержаний з Національного банку культур тканин ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Пухлину трансплантували шляхом введення 250-300тис. живих клітин у м'язи гомілки, згідно загальноприйнятої методики. Перебіг пухлинного процесу характеризували за стандартними показниками [2]: - частотою виникнення (прищеплюваності) пухлин; - середнім об'ємом (мм ) та масою (г) пухлинного вузла; - частотою метастазування (% мишей у кожній групі, які мали метастази в легенях); - інтенсивністю метастазування (середньою кількістю метастазів на одну тварину); - швидкістю росту метастазів (за середнім 3 об'ємом метастазів у мм на одну тварину). При визначенні об'єму метастазів форму метастатичних вузлів приймали за сферичну. Розрахунки проводили після вимірювання діаметра (d) кожного метастазу за формулою: 3 V=0,52d . 3 Об'єм пухлини (у мм ) розраховували за наступною формулою: 2 V=6 А В де А - довжина, В - ширина пухлинного вузла. ДНК-вмісна фракція з культуральної рідини Bacillus subtilis GP1-807-03 була отримана за стандартною схемою виділення плазмідної ДНК із застосуванням преципітації у поліетиленгліколі 6000 з подальшою преципітацією у 70% етанолі [3,4]. Технологія отримання міцелярного комплексу на основі глікопептидних антигенів пухлинних клітин і CpG-ДНК бактеріального походження. Міцелярний комплекс на основі глікопептидів пухлинних клітин і бактеріальної ДНК, збагаченої на неметильовані CpG-мотиви, був отриманий з метою підвищення імуногенності пухлинних антигенів та, як наслідок, підвищення ефективності протипухлинної вакцини в цілому. В основу техно (19) UA (11) 48694 (13) U 3 3 48694 логії отримання даного міцелярного комплексу була покладена здатність двох по-різному заряджених біомолекул взаємодіяти між собою з утворенням так званих міцел. Глікопептидні антигени з молекулярною масою 50кДа (gp50) були отримані з клітин меланоми В16 згідно методики, описаної у [5]. Кількість пухлинних клітин, з яких виготовлена gp50 - так званий клітинний еквівалент - визначали за вмістом ДНК, що вивільняється з операційного матеріалу після протеолітичного руйнування пухлинних клітин. Після проведення етапу осадження за допомогою сульфату амонію антигенів пухлинного походження до суспензії останніх додавали неметильовану CpG-ДНК, отриману описаним вище способом з культуральної рідини Bacillus subtilis GP1-807-03 у співвідношенні 20мкг ДНК до 1млн. екв. пухл. клітин. Такий вибір співвідношення складових комплексу зумовлений результатами попередніх досліджень, які вказують, що окреме чи поєднане застосування даних компонентів у вказаних вище дозах є оптимальним і характеризується високими показниками ефективності. Після 15хв інкубації за кімнатної температури проводили осадження за звичайною схемою. Ідентифікацію отриманого міцелярного комплексу здійснювали за допомогою електрофорезу у вертикальних пластинах поліакриламідного гелю (ПААГ), у системі буферів Laemmli, з використанням 0,1% додецилсульфату натрію. Схема вакцинації міцелярним комплексом вакцина-ДНК 4 Комплекс вакцина-ДНК тричі вводили мишам у дозі 1млн. екв. пухл. клітин/20мкг в об’ємі 0,2мл ізотонічного розчину хлориду натрію, з інтервалом у 3 доби, починаючи на 3-ї доби після трансплантації пухлини. В якості препарату порівняння було використано аналогічно отриманий комплекс на основі глікопептидів пухлинних клітин і ДНК з еритроцитів курчати (ЕК), вміст неметильованих CpG-мотивів в якій значно нижчий, ніж у ДНК бактеріального походження. Отримані результати проілюстровано Фіг.1, 2 та таблицею. Застосування gp 50 і CpG ДНК окремо та у вигляді міцелярного комплексу вакцина-ДНК на моделі меланоми В-16 виявило, що введення тваринам окремих компонентів не відзначається вираженим гальмівним впливом на ріст пухлини (у випадку ДНК з еритроцитів курчати чи її комплексу з вакциною можна відмітити навіть певну тенденцію до виявлення стимуляції пухлинного росту (Фіг.1, 2). Як при аналізі показників динаміки росту пухлини (Фіг.1), так і у випадку показників маси пухлини (Фіг.2) лише при застосуванні комплексу gp50-CpG ДНК було виявлено статистично достовірне (р