Протипухлинний засіб на основі комплексу платини з днк і спосіб його одержання

1. Протипухлинний засіб на основі водного розчину похідної платини з поліаніоном дезоксирибонуклеїнової кислоти, що містить неасоційовані макромолекули Pt-ДНК розміром 0,05-0,15 мкм в найбільшому вимірі, натрій хлористий, натрій лимоннокислий, амоній хлористий і фторурацил у вигляді натрієвої солі, який відрізняється тим, що C2 2 (19) 1 3 86338 4 поліаніоном дезоксирибонуклеїнової кислоти in Відомий протипухлинний засіб на основі водsitu (Pt-ДНК), що включає неасоційовані макромоного розчину похідної платини з поліаніоном дезолекули Pt-ДНК розміром 0,05-0,15мкм в найбільксирибонуклеїнової кислоти in situ (Pt-ДНК) (актившому вимірі, натрій хлористий, натрій лимоннокина речовина), що включає неасоційовані слий, амоній хлористий і фторурацил у вигляді макромолекули Pt-ДНК розміром 0,05-0,15мкм в натрієвої солі, згідно винаходу, додатково містить найбільшому вимірі, натрій хлористий, натрій лиурацил і сечовину в мольному співвідношенні моннокислий, амоній хлористий і фторурацил у фторурацилу, урацилу і сечовини 1:1:1, при співвигляді натрієвої солі (допоміжна речовина) при відношенні компонентів у водному розчині, мас.%: співвідношенні компонентів у водному розчині, Pt-ДНК 0,130-0,153 мас. %: натрій хлористий 0,080-0,090 Pt-ДНК 0,130-0,153 натрій лимоннокислий 0,040-0,053 натрій хлористий 0,080-0,090 амоній хлористий 0,015-0,018 натрій лимоннокислий 0,040-0,053 натрієва сіль фторурацилу 0,025-0,370 амоній хлористий 0,015-0,018 урацил 0,018-0,270 натрієва сіль фторурацилу 0,025-0,370 сечовина 0,010-0,144, [див. деклараційний пат. України №70456, а також натрію гідроксид до досягнення рН 8,4-9,9. публ. 15.10.2004, заявники Шалімов C.O., ВолченПри цьому щільність розчину досягає1,0054 скова І.І., Майданевич Н.М.]. 1,0058 г/см3. Як показали дослідження, водний розчин віВідомо застосування урацилу у складі протидомого засобу має рН 6,5-7,5 і щільність 1,0012пухлинної композиції з тегафуром в мольному 1,0016г/см3, при яких неасоційовані молекули споспіввідношенні тегафуру та урацилу 1:4 [Пат. США луки Pt-ДНК мають найбільш високу протипухлин5534513, МПК7 А61К31/505, заявник ТАІНО ну активність, а фторурацил має здатність підсиPHARMACEUTICAL CO LTD (JP), публ. 1996-07лювати цю активність і зменшувати токсичність 09]. похідної платини при витримуванні одержаного Відомо застосування сечовини як діуретика, засобу в інтервалі температур вище 35°С. Зникератолітика, засобу, що знижує внутрішньочерепження температури сприяє основам молекул Ptний і внутрішньоочний тиск [М.М. Туркевич. ФарДНК вступати у внутрішньомолекулярні взаємодії мацевтична хімія, 1973, стр.45], як ексципієнта, що кооперативного характеру інтенсивніше, ніж у додається в тверді дозовані лікарські форми для міжмолекулярні взаємодії із спорідненими аніонаперорального введення. ми фторурацилу натрієвої солі, і тому просторові Відомо застосування натрію гідроксиду у фарструктури молекул Pt-ДНК необоротно конденсумації для регулювання рН розчинів лікарських заються. Внутрішньомолекулярна конденсація струксобів. Крім того, відомо, що під дією високих контур, що містять дуже маленькі атоми платини з центрацій сечовини і при рН>11,0 спіралізовані щільністю 21,45г/см3, приводить до зменшення подвійні нитки природної ДНК розплітаються [Лепросторових структур молекул Pt-ДНК до таких нінджер. Біохімія, 1976, стор.737]. розмірів, що їх плавуча щільність перевищує щільПро застосування урацилу, сечовини і натрію ність розчину, і вони під дією сили тяжіння осідагідроксиду як засобів, що запобігають внутрішньоють у вигляді пухкого осаду. При цьому аніони молекулярній конденсації спіралізованих ниток фторурацилу схильні взаємодіяти в більшій мірі з сполук металів з ДНК, не відомо. Не відомо також протонами розчину ніж з основами Pt-ДНК, і тому про застосування сечовини в дозованих формах переходять в стан нейтральних молекул власної лікарських препаратів для панентерального ввеоснови, розчинність якої обмежена у воді, яка осідення. Ефективні інтервали концентрацій і співвіддає у вигляді кристалів і яка при підвищенні темношення активної субстанції, фторурацилу і солей ператури розчиняється. Осадження активної та у водному розчині засобу, який заявляється, віддопоміжної речовин викликає зменшення їх концеповідають співвідношенням, встановленим при нтрації в розчині засобу, і тим самим знижує його розробці відомого засобу для внутрішньоочерепротипухлинну активність і терапевтичну ефективвинних, внутрішньовенних ι внутрішньоартеріальність та обмежує його застосування тільки місцених інфузій, що витримуються при температурі 35вими аплікаціями і внутрішньочеревинними інфузі40°С Інтервали концентрацій урацилу і сечовини ями, виключаючи внутрішньовенні, детерміновані мольним співвідношенням фторувнутрішньоартеріальні інфузії і інтерстиціальний рацилу, урацилу і сечовини 1:1:1. Інтервали коншлях введення. центрацій натрію гідроксиду обмежені знизу знаЗадачею винаходу є створення протипухлинченням рН, що виключає можливість протонування ного засобу, в якому шляхом додавання до відофторурацилу, а зверху-фармацевтичними вимомого засобу урацилу, сечовини та натрію гідроксигами. ду забезпечують можливість запобігти Відомий спосіб одержання протипухлинного внутрішньомолекулярній конденсації основної резасобу шляхом витримування протягом 16-26 гочовини та протонуванню допоміжної речовини і дин волокон ДНК в цитратно-сольовому розчині, тим самим уникнути їх осадження та зменшення їх що містить натрій хлористий і натрій лимоннокисконцентрації у розчині в інтервалі температур 25лий, розчинення волокон при механічному пере15°С, чим досягають підвищення протипухлинної мішуванні і нагріванні розчину ДНК до 70-90°С, активності та терапевтичної ефективності засобу поступового введення в нагрітий розчин ДНК ната розширення його застосування. грітого до такої ж температури цитратно-сольового Задача вирішується тим, що протипухлинний розчину цис-дихлородіамінплатини (ДДП), додазасіб на основі водного розчину похідної платини з 5 86338 6 введення в нагрітий розчин ДНК нагрітого до тієї ж вання до суміші водного розчину натрієвої солі температури цитратно-сольового розчину цисфторурацилу та термостатування суміші розчинів дихлородіамінплатини (ДДП), термостатування ДНК і ДДП при 70-90°С протягом 15-20 хвилин суміші розчинів ДНК і ДДП при 70-90°С протягом [див. деклараційний пат. України №70456, публ. 15-20 хвилин і додавання до суміші перед термо15.10.2004, заявники Шалімов C.O., Волченскова статуванням водного розчину натрієвої солі фтоІ.І., Майданевич Н.М.]. рурацилу, згідно винаходу, перед термостатуванДодавання водного розчину натрієвої солі ням одночасно разом з водним розчином натрієвої фторурацилу до суміші розчинів ДНК і ДДП перед солі фторурацилу додатково вводять водний розтермостатуванням не сприяє посиленню міжмолечин урацилу та водний розчин сечовини з конценкулярних взаємодій молекул Pt-ДНК із споріднетраціями, що відповідають мольному співвідноними молекулами розчину і ослабленню внутрішшенню фторурацилу, урацилу і сечовини 1:1:1, і ньомолекулярних взаємодій кооперативного водний розчин натрію гідроксиду з рН 11,0-12,0, а характеру в них та не виключає можливість взаєпотім розчин засобу доводять до рН 8,4-9,9 та до модіяти аніонам фторурацилу з протонами розчищільності 1,0054-1,0058г/см3. ну при температурах нижче 35°С Саме цим відоЗапропонований спосіб одержання протипухмий спосіб не запобігає необоротну линного засобу дозволяє досягти підвищених знавнутрішньомолекулярну конденсацію просторових чень рН і щільності розчину, що виключає можлиструктур Pt-ДНК і не перешкоджає протонуванню вість взаємодії фторурацилу з протонами розчину, аніонів фторурацилу в розчині засобу. Для уникщо, в свою чергу, забезпечує отримання засобу з нення цих явищ необхідно перед термостатуванмакромолекулами Pt-ДНК, які не конденсуються, ням проводити додаткові технологічні операції розміром 0,05-0,15мкм в найбільшому вимірі при введення в розчин засобу компонентів, які б підтемпературі витримування готового засобу в інвищували його рН, а також щільність. Крім того, тервалі 25-15°С. При цьому підвищення щільності протипухлинний засіб, отриманий відомим спосорозчину попереджає осадження макромолекул з бом, можливо використовувати лише при темперозчину засобу. ратурі 35-37°С, тому що при зниженні температури На практиці протипухлинний засіб одержували активність засобу зменшується. До того ж висока таким чином. температура засобу ускладнює його зберігання, Волокна ДНК витримували протягом 16-26 готранспортування та використання. дин в цитратно-сольовому розчині, що містив наЗадачею винаходу є розробка способу одертрій хлористий і натрій лимоннокислий. Розчиняли жання протипухлинного засобу, в якому шляхом їх при механічному перемішуванні і нагріванні розвикористання водних розчинів урацилу, сечовини і чину ДНК до 70-90°С. В нагрітий розчин ДНК понатрію гідроксиду при відповідних технологічних ступового вводили нагрітий до тієї ж температури умовах досягають, з одного боку, ослаблення інцитратно-сольовий розчин цистенсивності внутрішньомолекулярних взаємодій дихлородіамінплатини (ДДП). Потім додавали до кооперативного характеру в молекулах Pt-ДНК і, з суміші водний розчин натрієвої солі фторурацилу. другого боку, посилення інтенсивності взаємодії їх Одночасно разом з водним розчином натрієвої основ із спорідненими молекулами розчину, а сасолі фторурацилу додатково вводили водний розме з фторурацилом, урацилом і сечовиною, які чин урацилу і водний розчин сечовини з концентзабезпечують можливість створити засіб, що місраціями, що відповідали мольному співвідношентить активну речовину Pt-ДНК, молекули якої не ню фторурацилу, урацилу і сечовини 1:1:1, і конденсуються при температурі витримування водний розчин натрію гідроксиду з рН 11,0-12,0, готового засобу в інтервалі 25-15°С, що, в свою чим розчин засобу доводили до рН 8,4-9,9 та чергу, попереджає та запобігає осадженню макрощільності 1,0054-1,0058г/см3. Після цього суміші молекул з розчину. розчинів ДНК і ДДП протягом 15-20 хвилин витриПоставлена задача вирішується тим, що в мували при температурі 70-90°С способі одержання протипухлинного засобу шляПриклади одержання протипухлинного засобу хом витримування протягом 16-26 годин волокон наведені в таблиці 1, де приклади 1-3 стосуються ДНК в цитратно-сольовому розчині, що містить засобу, що заявляється, а приклад 4 - відомого натрій хлористий і натрій лимоннокислий, розчизасобу. нення волокон при механічному перемішуванні і нагріванні розчину ДНК до 70-90°С, поступового Таблиця 1 Умови одержання засобу № прикладу 1 2 3 4 Кількість початкових компонентів, г/л ДНК 0,67 0,68 0,74 0,72 ДДП NaCI Na3Cyt NaFu Urа Urea NaOH 0,87 0,92 0,96 0,96 0,80 0,86 0,90 0,90 0,40 0,48 0,53 0,50 3,70 2,50 0,25 2,50 2,70 1,84 0,18 1,44 0,99 0,10 0,80 0,72 0,60 Температура Час витриму- навівання і вання ДНК, термостатугодини вання, °С 20 26 16 26 90 70 85 85 7 86338 8 них речовин дорівнює 0,0016. Таким чином, водВ таблиці означені: NaCI - хлористий натрій, ний розчин урацилу і водний розчин сечовини Na3Cyt - натрій лимоннокислий, NaFu - натрієва вводили з концентраціями, що відповідали мольсіль фторурацилу, Ura - урацил, Urea - сечовина. ному співвідношенню фторурацилу, урацилу і сеПри молекулярних масах урацилу 112г-моль, човини 1:1:1. фторурацилу 153г-моль, сечовини 60г-моль для Характеристики засобу, що заявляється, запершого прикладу число молей урацилу дорівнює лежно від умов отримання було порівняно з харак2,70/112=0,024; фторурацилу - 3,70/153=0,024; теристиками відомого засобу. Результати наведені сечовини - 1,44/60=0,024; для другого прикладу в таблиці 2, де приклади 1-3 стосуються засобу, число молей для вказаних речовин дорівнює 0,016 що заявляється, а приклад 4 - відомого засобу. та для третього прикладу число молей для вказаТаблиця 2 № при- Температура кладу витримування, PtNaCI °С ДНК 1 2 3 4 15 15 20 25 20 25 15 0,130 0,142 0,142 0,142 0,153 0,152 0,152 0,082 0,080 0,080 0,080 0.090 0.085 0,085 Характеристика одержаного засобу Склад засобу, мас % NaOH до Na3Cyt NH4CI NaFu Ura Urea досягнення pH розчину 0,053 0,015 0,370 0,272 0,142 9,9 0,048 0,016 0,250 0,182 0,098 8,4 0,048 0,016 0,250 0,182 0,098 8,8 0,048 0,016 0,250 0,182 0,098 9,2 0,040 0,018 0,025 0,016 0,010 8,8 0,046 0,015 0,250 6,9 0,046 0,015 0,250 6,6 Розмір Щільність молекул розчину Pt-ДНК г/см3 мкм 0,05-0,15 1,0056 0,05-0,14 1,0058 0,05-0,15 1,0054 0,05-0,15 1,0054 0,05-0,15 1,0056 0,03-0,07 1,0012 0,02-0,05 1,0016 ембріональна теляча сироватка (30-40%), глюкоза (800 міліграм %), інсулін (0,2од/мл) при постійному режимі газового складу і температурі 36,5°С в інкубаторі. Через 4 доби після посіву в період інтенсивного росту клітини контрольної культури обробляли фізіологічним розчином, а клітини експериментальних культур обробляли розчинами засобу, що заявляється, і розчином відомого засобу, витриманих при температурах 25-15°С. Час інкубації після обробки культур склав 24 години. Протипухлинну активність оцінювали за цитотоксичністю, яку характеризували по відносній в порівнянні з контролем кількості загиблих клітин. Результати підрахунку відносної кількості загиблих клітин, виражені у відсотках, відображені в таблиці 3, де наведені під №1 показники контрольної культури клітин, обробленої фізіологічним розчином; під №№2-4 - показники експериментальних культур клітин, оброблених розчинами засобу, що заявляється; під №5 - показники експериментальних культур клітин, оброблених розчином відомого засобу. Дані таблиці 3 наведені без відомостей про концентрацію солей натрію хлористого, натрію лимоннокислого та амонію хлористого. Відмінності у водних розчинах засобу, що заявляється, і відомого, підтверджуються різними значеннями рН, які визначені потенціометрично, і різними величинами щільності, знайденими пікнометрично. Відмінності в просторових структурах молекул Pt-ДНК, які утворюються при температурі нижче 35°С у відомому засобі і у засобі, що заявляється, підтверджуються у прикладах таблиці різними розмірами їх в молекулярних структурах, які за даними електронної мікроскопії відрізняються один від одного в 2-3 рази. Розмір молекулярних структур у прикладах за засобом, який заявляється, відповідає розміру неасоційованих індивідуальних макромолекул речовини, що підтверджує відсутність внутрішньомолекулярної конденсації молекул Pt-ДНК в засобі, витриманому при температурі 25-15°С Протипухлинну активність відомого засобу і засобу, що заявляється, досліджували в тесті цитотоксичності на моделі культивованих клітин, отриманих з операційного матеріалу хворого злоякісною олігодендроастроцитомою головного мозку. Клітини культивували в живильній суміші стандартного складу: середовище Ігла (40%), Таблиця 3 Культура клітин № п/п Препарат 1 2 Фізіологічний розчин Засіб за прикладом №1 3 Засіб за прикладом №2 4 Засіб за прикладом №3 5 Засіб за прикладом №4 Температура витримування °С 15 15 20 25 20 25 15 Концентрація, Відсоток загиблих мкг/мл клітин PtNaFu Urа Urea ДНК 0,7 30,0 74,0 54,028,0 96,0 30,0 50,0 36,020,0 86,8 30,0 50,0 36,020,0 84,3 30,0 50,0 36,020,0 86,2 30,0 5,0 3,6 2,0 64,7 30,0 50,0 52,1 30,0 50,0 24,2 9 86338 Дані таблиці 3 свідчать, що при порівнянні кількісної оцінки протипухлинної активності в тесті цитотоксичності, засіб, що заявляється, істотно перевершує відомий. Витриманий при однаковій температурі 15°С і введений в культуру при однакових концентраціях похідної Pt-ДНК 30мкг/мл і фторурацилу 50мкг/мл відомий засіб викликає загибель тільки 24,2% клітин, тоді як той, що заявляється - 86,6%. Таким чином, запропонований засіб зберігає свою високу протипухлинну активність та терапевтичну ефективність навіть при температурах 25°15°С, що значно спрощує його зберігання, транспортування та використання. Запропонований засіб може бути використаний в різних дозованих формах. Протипухлинний засіб, що заявляється, був застосований в клінічній терапії первинних і метастатичних пухлин легенів, нирок, канцероматозі очеревини та плеври, органів травлення і опорнорухового апарату з дозованих формах для внутрі Комп’ютерна верстка А. Рябко 10 шньовенного, внутрішньоартеріального і внутрішньоочеревинного введення, у терапії пухлинних уражень голови, шиї і шкіри - в дозованих формах для місцевого застосування у вигляді аплікацій; при пухлинах головного мозку - інтерстиціально з внутрішньоопераційною імплантацією резервуару Оммуа в ложе хірургічно видаленої пухлини. Досвід клінічного застосування засобу, що заявляється, показав, що використання його дозованих форм як для внутрішньоочеревинного і місцевого застосування, так і дозованих форм для внутрішньовенного, внутрішньоартеріального та інтерстиціального введення, підвищує ефективність хіміотерапії, яка виражається в збільшенні тривалості життя хворих і підвищенні якості життя під час проведення курсу лікування і у віддалений період часу. При цьому яких-небудь істотних клінічних або лабораторних проявів побічних ефектів у хворих не було виявлено. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601