Штам бактерій rhizobium meliloti для одержання бактеріального добрива під люцерну

Штам бактерій Rhizobium mehloti 12 (колекція Інституту фізіологи рослин і генетики НАН України) для одержання бактеріального добрива під люцерну Винахід відноситься до сільського господарства, до мікробіологічних засобів підвищення насіннєвої продуктивності люцерни, а саме до нових штамів Rhizobium mehloti для виготовлення бактеріальних добрив під згадану культуру Відомо, ЩО протягом багатьох років для виробництва бактеріальних добрив під люцерну використовували штам Rhizobium mehloti 425а (Авторське свідоцтво СРСР № 549454, кл С05 F 11/08, 25 05 77) Недоліком цього штаму є те, що в ряді районованих сортів люцерни спостерігається невисока азотфіксуюча активність, низька ефективність і нестабільність урожаю при бактеризації насіння люцерни цим штамом Найближчим до штаму, що пропонується, є штам Rhizobium mehloti 4 (патент України № 13298, кл С 05 F 11/08, С 12 N 1/20 28 02 97 та авторське свідоцтво СРСР № 1760743, 01 08 90) Штам Rhizobium mehloti 4 характеризується високим рівнем азотфіксуючої активності, яка в 1,8 раза перевищує штам-стандарт 425а, збільшує урожай зеленої маси і сіна люцерни на 10 - 30% при одночасному високому ВМІСТІ сирого протеїну в продукції, стійкий до підвищених концентрацій мінерального азоту в ґрунті (ІЧбо), але недоліком цього штаму є низька насіннєва продуктивність люцерни при інокуляції ним даної культури нового штаму Rhizobium mehloti 12 з використанням генетико-селекційних методів (завдяки міжродовій кон'югації і багатоступінчастого відбору) із штаму Rhizobium mehloti 425a - симбіотичного азотфіксатора, який використовується для виробництва бактеріального добрива під люцерну Штам Rhizobium mehloti 12 зберігається в колекції Інституту фізіологи рослин і генетики НАН України (м Київ) Штам характеризується наступними культурально-морфолопчними ознаками культура бактерій не спороносна, грам-негативна, клітини мають форму дрібних паличок розміром 0,5 - 1,2мкм, палички рухливі, мають 2 - 6 перитрихіальні джгутики Бактерії пігмент на продукують На манітно-дріжджовому агарі (МДА) (г/л К 2 НРО 4 -0,5, MgSO4 7Н2О - 0,2, NaCI - 0,1, маніт10,0, дріжджовий екстракт - 1,0, агар - 15,0 - 20,0, дист вода, рН - 7,0) при розсіві штрихом на 3 - 4 добу колонії мають округлу форму, випуклі, білуваті На 5 - 7 день продукують багато слизу Культура швидкоросла, не патогенна На рідкому середовищі Норіса (г/л К2НРО4 0,5, MgSO4 7Н2О - 0,8, NaCI - 0,2, FeCI3 - 0,01, маніт - 10,0, дріжджовий екстракт- 1,0, дист вода) культура бактерій Rhizobium mehloti 12 засвоює глюкозу, маніт, порівняно зі штамом-аналогом слабо асимілює мальтозу і сахарозу На синтетичному середовищі 79 (г/л К2НРО4 0,5, MgSO4 7Н2О - 0,2, NaCI - 0,1, СаСО3 - сліди, маніт - 10,0, агар - 17,0, дист вода) - колонії білі, випуклі, блискучі, на 5 - 7 день розтікаються Ріст на м'ясо-пептонному бульйоні при 27°С характеризується помутнінням середовища, колір якого не В основу винаходу доставлена задача створити новий штам бульбочкових бактерій люцерни з високою азотфіксуючою активністю, який дозволяв би не лише підвищувати врожай зеленої маси люцерни, а й забезпечував би суттєве зростання насіннєвої продуктивності цієї культури Це завдання вирішується шляхом отримання ЗМІНЮЄТЬСЯ о ю 00 о ю Фізюлого-бюхімічні ознаки запропонований штам є мікроаерофілом Температурний діапазон росту - 20 - 28°С Оптимальна температура росту - 27°С Діапазон рН 6,5 - 7,4 Оптимальна рН - 7,2 Культура бактерій Rhizobium mehloti 12 відновлює нітрати, утворює сірководень, не розріднює желатину, крахмал не пдролізує, використовує казеїн та гідролізат лактальбумину Має каталазну та уреазну активність, пдролізує казеїн Добре росте на м'ясо-пептонному агарі Генетичні особливості прототроф, стійкий до ряду антибіотиків (стрептоміцина сульфат 250мкг/мл, канаміцина сульфат - 25мкг/мл, тетрацикліна пдрохлорид - 15мкг/мл) Штам непатогенний, має серотип штаму 425а Штам Rhizobium mehloti 12 ідентифікований за визначником Берги, 1980, М "Мир" С 495 Культура зберігається на манітнодріжджовому агарі (МДА) (рН 7,0) або середовищі 79 (рН 7,2) під мінеральним маслом при кімнатній температурі або в холодильнику при температурі 4 - 5°С на цих же середовищах без масла Пересівають один раз на рік, добавляють в середовище антибіотики - стрептоміцина сульфат - 250мкг/мл, канаміцина сульфат - 25мкг/мл, тетрацикліна пдрохлорид - 15мкг/мл Після 15 пересівів на середовищі 79 без антибіотиків штам Rhizobium mehloti 12 добре росте на цьому ж середовищі з додаванням антибіотиків, тобто СТІЙКІСТЬ до антибіотиків є стабільною ознакою Запропонований штам добре росте на середовищі 79 з додаванням трьох антибіотиків - стрептоміцину, канаміцину і тетрацикліну, утворює білі слизуваті колонії Дослідження СТІЙКОСТІ штаму Rhizobium mehloti 12 до антибіотиків в умовах симбіозу (стерильний мікровегетаційний дослід) показало, що реїзоляти із бульбочок 30-денних рослин люцерни сортів Заикевича і Ярославна зберігають СТІЙКІСТЬ до трьох перерахованих антибіотиків Електрофоретичне дослідження плазмідної ДНК показало наявність додаткової плазміди з меншою молекулярною масою порівняно із базовим штамом Rhizobium mehloti 425a Таким чином, штам Rhizobium mehloti 12 відрізняється від штаму 425а за фізюлого-бюхімічними і генетичними ознаками, а також більш високою азотфіксуючою активністю і ефективністю Приклад Штам Rhizobium mehloti 12 вирощували на поживному середовищі - манітнодріжджовому агарі (МДА) при 27°С протягом 3 - 4 діб у пробірках, потім змивали стерильною водою і готували густу суспензію, якою засівали матраци з МДА (об'єм - 1,5л) Інкубацію проводили протягом 50851 З - 4 днів при температурі 27°С Готували густу суспензію (50мл), змиваючи культуру з агару стерильною водою У добре подрібнений, перемішаний торф (200г/га) вводили стерильною піпеткою або шприцом 50мл суспензії і добре перемішували Приготовлений таким чином ризоторфін розміщували в термостат на 3 - 5 діб при температурі 27°С Після термостатування перевіряли титр бактерій - в 1г торфу повинно бути не менше 1-1,5 млрд клітин Rhizobium mehloti 12, і проводили інокуляцію насіння Для цього гектарну норму насіння зволожували (1 - 2% від маси насіння), рівномірно перемішували з ризоторфіном, підсушували в ТІНІ І висівали в грунт Ефективність штаму Rhizobium mehloti 12 перевіряли на сортах люцерни "Ярославна", "Заикевича" і "Херсонська" в мікровегетаційних (перліт, середовище Красильникова-Кореняко) і вегетаційних дослідах на промитому річковому піску і грунті (суміш Гельрігеля з 0,2 і 0,5 нормами азоту), а також у польових дослідах на темно-сірому опідзоленому середньосуглинковому грунті (Львівська обл 1989 - 1994 рр) і на сірому опідзоленому (лісовому) супіщаному грунті (Київська обл 1990 1994 рр) У цих грунтах розповсюджені досить агресивні раси спонтанних форм бульбочкових бактерій люцерни Азотфіксуючу активність штаму, що пропонується, визначали в мікровегетаційних і вегетаційних дослідах по редукції ацетилену в етилен Як видно із табл 1, штам Rhizobium mehloti 12 вступає в ефективний симбіоз з люцерною, активно фіксує атмосферний азот і за азотфіксуючою активністю перевищує штам-стандарт 425а в 2,1 рази, а штам Rhizobium mehloti 4 в 1,3 рази, підвищує урожай насіння люцерни на 24,8% порівняно із штамом-стандартом і на 11,0% порівняно із штамом 4 Результати ефективності запропонованого штаму Rhizobium mehloti 12 в різних грунтовокліматичних зонах наведені в табл 2 - 4 Штам, що пропонується, за ефективністю суттєво перевищує базовий штам і штам Rhizobium mehloti 4 Новий штам протягом всього періоду досліджень достовірно перевищував не лише урожай зеленої маси люцерни, а також і урожай насіння Залежно від грунтово-кліматичної зони надбавка урожаю зеленої маси при інокуляції штамом, що пропонується, складала від 24 до Збц/га (8,1 - 14,5%) (табл 3), а насіння від 0,20 до 0,21 ц/га (15,4 - 22,7%) (табл 2, 4) порівняно із штамом Rhizobium mehloti 425a Таблиця 1 Урожай насіння люцерни сорту Заикевича в вегетаційному ДОСЛІДІ, 1994 рік Варіант Урожай по повторнос- Середній Надбавка до кон- Надбавка до тях, г/посудину тролю штаму 425а урожай, II І III IV V г/посудину г/посудину % г/посудину % 1 Контроль (спонтанна іно- 3,0 3,2 2,8 2,9 3,4 3,06 ±0,11 куляція) Азотфіксуюча активність С2Н4 • росл 1 •год 1 0,21 ±0,03 50851 Продовження таблиці 1 Варіант Урожай по повторнос- Середній Надбавка до кон- Надбавка до штаму 425а тях, г/посудину тролю урожай, II І III IV V г/посудину г/посудину % г/посудину % 2 Базовий штам Rhizobium 3,4 3,5 3,2 3,4 3,4 3,38 ± 0,05 mehloti 425a 3 Штам Rhizo4,2 3,6 3,6 3,8 3,8 3,80 ±0,11 bium mehloti 4 4 Запропонований штам Rhizo- 4,3 4,0 4,0 4,1 4,1 4,22 ± 0,09 bium mehloti 12 НІР0 5, г/посудину Азотфіксуюча активність С2Н4 • росл 1 • г о д 1 0,63 ± 0,22 0,97 ± 0 , 1 0 37,9 1,16 0,84 24,8 1,30 ± 0 0 , 0 8 0,29 Таблиця 2 Урожай насіння люцерни сорту Ярославна, 1989 р (Львівська обл ) Урожай по повторностях, ц/га II І III IV Варіант 1 Контроль (спонтанна інокуляція) 2 Базовий штам Rhizobium mehloti 425a 3 Штам Rhizobium mehloti 4 4 Запропонований штам Rhizobium mehloti 12 HIPos, Ц/га Середній урожай, ц/га 0,76 0,94 0,84 0,78 0,82 0,87 0,88 1,03 0,87 0,91 1,02 1,05 1,15 1,08 ± 0 , 0 3 0,20 0,94 ± 0,03 1,10 0,25 0,88 ± 0,03 0,95 Надбавка до штаму 425а ц/га % 0,83 ± 0,04 0,95 Надбавка до контролю ц/га % 30,1 22,7 0,10 Таблиця З Урожай зеленої маси люцерни Київська обл кий р-н Львівська обл р-н Підвищення урожаю, ц/га при використанні штамів 425а 4 12 Сорт люцерни Місце проведення досліджень ВасильківсьЖовківський Урожай зеленої маси в контролі, ц/га Херсонська 285 10 38 34 Зайкевича 237 12 59 48 Таблиця 4 Урожай насіння люцерни сорту Ярославна другого року вегетації 1993р (дослідне сільськогосподарське виробництво НАН України, Київська обл ) Варіант Урожай по повториостях ц/га Середній урожай, ц/га І 1 Контроль (спонтанна інокуляція) 2 Базовий штам Rhizobium mehloti 425a 3 Штам Rhizobium mehloti 4 4 Запропонований штам Rhizobium mehloti 12 HIPos, Ц/га І II IV V 1 29 1 ЗО 1 20 1,18 1 13 1 ЗО 1 33 1,42 1 24 1 53 1 46 1,42 1 57 1 60 1 43 1,54 1 56 1,57 ±0,05 0,21 1,45 ±0,05 1 72 0,35 1,36 ±0,05 1 27 Надбавка до штаму 425а ц/га % 1,22 ±0,03 1 51 Надбавка до контролю ц/га % 0,15 28,7 15,4 50851 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71