Штам бактерій rніzовіuм меlіlоті для одержання бактеріального добрива під люцерну

УКРАЇНА (19) U А (н> 13298 (13) СІ (5і)5 С 05 F 11/08; С 12 N 1/20 ДЕРЖАВНЕ ПАТЕНТНЕ ВІДОМСТВО ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) ШТАМ БАКТЕРІЙ RHIZOBIUM MELILOTI ДЛЯ ОДЕРЖАННЯ БАКТЕРІАЛЬНОГО ДОБРИВА ПІД ЛЮЦЕРНУ 1 (20)95320611, 15.09.93 (21)4855995/SU (22)01.08.90 (24) 28.02 97 * "* (46)28.02.97. Бюл. № 1 (56) 1. Авторское свидетельство СССР ГМ= 549454, кл. С 05 F 11 /08, 25.05.77. 2. Авторское свидетельство СССР ISfe 1543915 н.п., кл. С 05 F 11/01. 16.11.87 (прототип). Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к микробиологическим средствам повышения урожая бобовых культур и представляет собой новый штамм Rhizobium meliloti 4 предназначенный для промышленного изготовления бактериального препарата клубеньковых бактерий ризоторфина для люцерны. Известен штамм Rhizobium meliloti 425a [1]. По средним данным за 2 года испытаний в полевых условиях эффективность штамма составила 65,4 ц/ra сена, прибавка урожая 14.5%. Недостатком известного штамма является невысокая азотфиксирующая активность, низкая эффективность и нестабильность урожая люцерны при бактеризации этим штаммом. Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Rhizobium meliloti 1755 [2]. Культурально-морфологические признаки штамма: Штамм клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti 1755 растет на питатель ных средах: бобовый агар. g, (72) Старченков Юхим Полікарпович, Нічик Майя Михайлівна, Петерсон Олена Володи мирівна, Яковець Лідія Михайлівна, Воро бей Надія Анатольевна, Коць Сергій Ярославович (73) Інститут фізіології рослині генетики Ака демії наук України (UA) (57) Штамм бактерий Rhizobium meliloti ВНИИСХМ-4для получения бактериального удобрения под люцерну. Штрих обильный, блестящий. Величина колоний на 2-3 сутки до 1 мм, круглые по форме, гладкие, блестящие, беловато-серого цвета, слизи немного К 15 суткам величина колоний увеличивается до 5 мм в диаметре, некоторые колонии начинают растекаться. Величина клеток 3-суточной культуры на боковом агаре - 0,8-1,5 х 0,5 0,7 мк Палочки в молодом возрасте подвижные. Бактероидные формы ветвистые. Грамотрицательные. Культура быстрорастущая. На мясо-пептонном агаре бактерии растут, но слабо, имеют скудный штрих с кремоватым оттенком. Края колоний гладкие. Штамм хорошо растет на жидких средах с кукурузным экстрактом, и мелассой. Физиолого-биохимические признаки: Аэроб Оптимум температуры и рН среды для роста штамма 26~28°С и 6,8 - 7,2 соответственно. Штамм растет также на среде Эшби и крахмалоаммичном агаре. Молоко с лакмусом не пептонизирует. Желатину не разжимает. Относится к источникам углерода: усваивает сахарозу, глюкозу, лактозу, манозу, мальтозу. Крахмал не гидролизует. Относится к источникам азота С > 00 О 13298 использует азотокислотные и аммонийные соли, аспзрагин. Признаки устойчивые. Штамм не патогенен. Штамм Rh^oblum melliotl 1755 ло сравнению со штаммом 425а более эффективен: урожай люцерны повышает на 5,8 - 8,5%. накопление сырого протеина выше в 1.2!,4 раза, усвоение азота воздуха протекает п 4 раза активнее при инокуляции растений этим штаммом по сравнению с 425а. Одновременно улучшаются кормовые достоинства укосной массы за счет большего накопления каротиноидоа (на 6,7 - 21,1%}, Урожай зеленой массы люцерны штамм увеличивал нч 26 - БО ц/га, сбор протеина - на 1,9 - 9,3 ц/гз з мел ко де л я ночных опытах, а в производственных условиях ™ на 20 - 50 ц/гэ. Задачей изобретения является получение нового штамма клубеньковых бактерий люцерны, обладающего высокой азотфиксирующей нктионостью и позволяющего стабильно повышать урожаи люцерны, давать большие прибавки урожая при высоком содержание азота о почее. Поставленная задача достигается тем, что ипамм Rhizoblum meliloti 4 получен с использованием генетико-селекционных приемов (путем межродовой коньюгации и многоступенчатого отбора) из штамма KN'obium meliloti 425a - симбиотического азотфиксатора, используемого для производства бактериального удобрения ризоторфина под люцерну. Полученный штамм бактерий Rhizobium ou'Ukiti 4 депонирован в коллекции микроорганизмов при научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии России под номером 4 (бывший Всесоюзный НИИ сельскохозяйственной микробиологии ВЛСХНИЛ) в группе азотфкксирующих микроорганизмов. Шгамм Rhizobium melllot) 4 характеризуется следующими культурально-морфолоіическими и физиолого-биохимическими признаками: культура бактерий - не спороносная, грзмотрицательная, клетки имеют палочковидную форму, размер палочек 0,5 1,2 мкм, палочки подвижны, имеют 2 - 6 перитрихальиых жгутиков. Культура аэробная, быстрорастущая, устойчива к анлибъготикэм; штамм не патоГЄ.ІЄН. Культивируемая на бобовом агаре при томперагуре 26-27°С в течение 3-4 дн. Темг.ературный диапазон роста 20 - 28°С.Оптимальная рН 7,2, диапазон рН 6,6 - 7,4. Из бобовом и мясо-пептон ном агарах и синтетических средах (среда Чапека) колонии круглы, выпуклые, гладкие, блестящие, беловата. На мясо-пептонном бульоне рост бактерий характеризуется помутнением среды, цвет которой остается неизменным, В отлично от штамма-аналога (базового 5 штамма) культура Rhizoblum meliloti 4 не разжижает желатину, не гидролизует крахмал. Слабо образует сероводород, обладает уреазной активностью, гидролизует казеин, подкисляет молоко с лакмусом. 10 Культура клубеньковых бактерий Rhl/oblum meliloti 4 восстанавливает нитраты. На жидкой среде Норриса усваивает глюкозу, мальтозу, маннит, слабо усваииает 15 сахарозу. Культуру хранят на маннитно-дрожжевом агаре (МДА) (рН 7,0) или среде № 79 (рН 7,2) под минеральным маслом при комнатной температуре. Пересеивают один раз в 20 год. добавляют антибиотики - стрептомицин сульфат - 500 мкг/мл, капамицми супьфат - 30 мкг/мл, тетрациклин - 20 мкг/мл. После 15 пересевов на среде № 79 без антибиотиков штамм Rhizobium meliloti 4 хо25 рошо растет на этой же среде с добапленмем антибиотиков, т.е. устойчивость к антибиотикам является стабильным признаком. Предлагаемый штамм хорошо растет на среде № 79 с добавлением трех антибио30 тиков стрептомицина, канамицина и тетрациклина, образуя белые слизистые колонии. Изучение устойчивости предлагаемого штамма к антибиотикам в условиях симбиоза (стерильный микровегетационный опыт) 35 показало, что все реизоляти из клубенька 30-дневных растений люцерны сорта Зайкевич сохранягатустойчивость к трем перечисленным выше антибиотикам. Электрофоретическоо разделение плаз40 мидной ДНК показало, что в отличие от штамма-аналога предлагаемый штамм содержит кроме 2-х мегаплазмид дополнительную плазмиду с меньшей молекулярной массой. 45 _ Штамм Rhizobium meliloti 4 идентифицирован по определителю Берги, 1980, М.: "Мир". Таким образом, штамм Rhizobium meliloti 4 отличается or штамма 425а физиолого-био50 химическими и генетическими признаками, а также более высокой аэотфиксирующей активностью и эффективностью (увеличивает урожай на 10-30%, табл. 1 - 4). Предлагаемый штамм сохраняет мор55 фол о ги чес кие, кулыурально-биохимические, генетические и симбиотические свойства в течение 5 лет. П р и м е р Штамм Rhizoblum meliloti 4 выращивали на питательной среде маннитно-дрохжевом агаре (МДА) при 27°С 3-4 13298 дня в пробирках, затем смывали стерильной водой с агара и готовили густую суспензию, которой засевали матрасы с МДА (объем -1,5 л). Состав среды МДА. г/л: дрожжевой экстракт - 1, маннит - 10, агар - 15-20, 5 K2HPO4-0,5.MgSChi 7Н2О-0,2. NaCI-0.1, дистиллированная вода до 1 л, рН - 7,0. Инкубировали 3-4 дня при температуре 27°С. Готовили густую суспензию (50 мл), смывая культуру с агара стерильной водой. 10 В хорошо измельченный, перемешанный торф (200-300 г/га) вводили стерильной пипеткой или шприцем 50 мл суспензии и хорошо перемешивали. Приготовленный таким образом ризоторфин помещали в тер- 15 мостат па 3-5 дней при температуре 27°С. После термостатирования проверяли титр бактерий-в 1 г торфа должно быть не менее 11,5 млрд. клеток Rhizobium meliloti 4 - й инокулировали семена. Для этого гектар- 20 ную норму семян увлажняли (1-2% от веса семян) и равномерно перемешивали с ризоторфином, подсушивали в тени и высевали в почву. Эффективность штамма Rhizobium 25 meliloti 4 проверяли в микровегетационных (перлит, среда Красильникова-Кореняко) и вегетационных опытах на речном промытом песке и почве (смесь Гельригеля с 0,2 нормами азота), а также в полевых опытах на 30 теммо-серой оподзолеиной среднесуглинисгой почве (Львовская обл., 1986-1989 гг.) и на серой оподзоленной (лесной) супесчаной почве (Киевская обл., 1988-1909 гг.). В этих почвах распространены довольно агрессив- 35 ные расы спонтанных форм клубеньковых бактерий люцерны. Азотфиксирующую активность предла гаемого штамма определяли в микровегетационных и вегетационных опытах по 40 редукции ацетилена в этилен. Как видно из табл. 1 штамм Rhizobium meliloti 4 вступает в эффективный симбиоз с люцерной, активно фиксирует атмосферный азот и по ацетиленвосстанавливающей активности превосходят 45 штамм-стандарт в 1.0 раза, п результате чего повышается урожай зеленой массы растений на 15,8% по сравнению со штаммом-стан дартом и увеличивается содержание общего азота в сене на 0,65% (фиг.). 50 б На фиг. видно, что расстояния сорта Херсонская 7 инокулированныо предлагаемым штаммом (сосуды 2, 4), крупные, образуют больше зеленой мдесы ч?м при инокуляции штаммом Rhizobium tnolflotl 425а (сосуды 3 и 5). Результаты полевых опытов по изучо нию эффективности штамма в различных почвенно-климатических услооилч приведены в табл. 2 и табл. 3. Из табл. 2 иЗ видно, что предлагаемый штамм по эффективности превосходит базовый штамм Новый штамм Rhizobium meliloti 4 на протяжении всего периода исследований достоверно повышает урожай зеленой массы люцерны в полевых условиях. В зависимости от почвенно-климатической зоны прибавка урожая зеленой массы при инокуляции предлагаемым штаммом составляет от 36 до 84 ц/га (10-30%) по сравнению со штаммом 425а (табл. 2 и 3). Растения, инокулированные штаммом Rhizobium meliloti 4 отличались также высоким содержанием общего азота (табл. 3). Эффективность штамма Rhizobium meliloti 4 в 1986-1989 гг. изучали также при внесении в почву повышенных доз минерального азота (N60). Как пидно из табл 4, предлагаемый штамм повышает урожай сена и при внесении 60 кг/га минерального азота. В зависимости от сорта прибавка урожая составила 6-7 ц/га (9.5-13,7%) Инокуляция предлагаемым штаммом Rhizobium meliloti 4 увеличивала также содержание азота в сене люцерны и обеспечивала высокий сбор протеина (табл 4). В результате проведенных исследований установлено, что предлагаемый штамм Rhizobium meliloti 4 по эффективности превосходит штамм-протогип R h i z o b i u m meliloti 1755. Новый штамм характеризуется более высоким уровнем азотфикпирующей активности, увеличивает урожай зеленой массы и сена люцерны на 10-30% при одновременно высоком содержании сырого протеина в продукции. Предлагаемый штамм устойчив к повышению концентрации азота в почве и обеспечивает при этом большие прибавки урожая люцерны Таблица 1 Урожай зеленой массы люцерны сорта Херсонская в вегетационном опыте, 1986 год Варианты Урожай по повторностям, г/сосуд Средний 1 1. Без инокуляции (конт II III IV V 85,4 86,3 86.2 85,7 85,2 Г/сосуд 93.5 93.5 92,2 92,0 93.5 107,2 108,7 106,8 110.2 108.5 108,3 Содержание азота в сене, % 2,15 3,94 ±0,25 о/ /о Азотфиксирующая активность, MKN* 1 С2Н4 раст . ч,' 0,95 ± 0,03 85,8 96,4 Прибавка к контролю 2,93 7,15 ±0,40 3,58 роль) 2. Базовый штамм Rhizobium melllotJ 425a 3. Предлагаемый штамм 22,5 26,2 to