Штам бактерій rніzовіuм lеguміnоsаruм для одержання бактеріального добрива під горох

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к микробиологическим средствам повышения урожая бобовых культур и представляет собой новый штамм Rh.teguminosaruml № 263 б, предназначенный для промышленного изготовления бактериального препарата клубеньковых бактерий - ризоторфина под горох. Известен штамм Rh.leguminosarum 250 б как активный симбиотический азотфиксатор, однако он обладает низкой эффективностью [Авт.св. СССР № 979307, кл. С 05 F11 /08,1982]. Известен штамм Rh.leguminosarum 250 а [Авт.св. СССР № 489750, кл. С 05 F 11/08, 1975], выбранный авторами в качестве прототипа, который увеличивает урожай зерна гороха на 1 ц/га и содержание белка на 0,4%, Недостатком известного штамма является неспособность образовывать клубеньки при пониженных плюсовых температурах, низкая активность и часто отсутствие эффекта от обработки семян гороха этим штаммом. Задачей изобретения является создание бактериального удобрения под горох на основе нового штамма клубеньковых бактерий Rh.leguminosarum Kfe 263 б, который имеет высокую азотфиксирующую активность и образует клубеньки при пониженных плюсовых температурах, что позволяет продлить период активной азотфиксации, увеличить урожай гороха за счет экологически чистого симбиотрофного питания. Штамм Rh.leguminosarum 263 б получен в 1986 г. в отделе симбиотической азотфяксации ИФРГ АН Украины методом экспериментальной селекции при использовании низких положительных температур, как селектирующего фактора. Полученный нами штамм депонирован в национальной Коллекции клубеньковых бактерий Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под номером 263 б в группе азотфиксирующих микроорганизмов. Штамм клубеньковых бактерий ІМг 263 б характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками: культура бактерий - неспороносная, граммотоицательная, подвижная. Размер клеток 0,8-2.5 мкм. Клетки имеют палочковидную форму, перетрихи. На бобовом агаре Мазе (г/л - горох -100,0, NaCI -1,0, сахароза - 20,0, агар - 18, вода до 1 л, рН 6,8-7,0) на 3 сутки роста штрихом образует блестящие беловатые колонии диаметром 0,1-0,3 см. При температуре инкубации 27°С культура образует интенсивный рост и интенсивную внеклеточную бесцветную пол-исахаридную слизь. На маннитно-дрожжевом агаре (г/л -дрожжевой экстракт * 1,0, маннит 10,0 KjHPO,, - 0,5, М 04-0.2, NaCI 0,1, агар 15-18, вода дистиллированная 1 л,рН 7,0) культура образует однотипные круглые, спизистые, выпуклые, беловатые колонии размером до 0,4 см. Температура инкубации 27°С. В отличие от штамма-прототипа культура клубеньковых бактерий № 263 б может расти на питательной среде при пониженных плюсовых температурах 8-10°С, образовывать клубеньки на 5. дней раньше, чем штамм-прототип, а также имеет более высокую азотфиксирующую активность и эффективность. Физиоло гобиохимические признаки. Аэроб, температурный диапазон роста 8-28°С, оптимальная температура 18-27°С роста. Оптимум рН - 7,0-7,2. Желатину не разжижает. Молоко с лакмусом не пепто-низирует, подщелачивает. Использует соли аммония и нитраты, редуцирует нитраты в нитриты. Сероводород не выделяет. На жидкой среде Норриса окисляет ряд Сахаров: мальтозу, глюкозу, галактозу, маннит, сахарозу, фруктозу, подкисляя среду. На мясо-пептонном агаре и бульоне не растет. Генетические особенности - протроф, устойчивый к ряду антибиотиков (налидиксо-вая кислота, неомицин, стрептомицин). Штамм 2636 идентифицирован по определителю Берге (1974) как штамм Rhirobium tegumlnosarum. Предлагаемый нами штамм клубеньковых бактерий гороха 2636 получен в 1986 г, в отделе симбиотической азотфиксации Института физиологии растений и генетики АН Украины, испытан в Географической сети опытов и на протяжении всего времени он сохраняет морфологические, культуральиобиохимические и симбиотические свойства. Пример 1. Исходным материалом для получения штамма служил активный штамм клубеньковых бактерий гороха 250а. Клубеньковые бактерии предварительно адаптировали к пониженным температурам путем высева на бобовый агар о течение 12 дней и проводили 3-4 пассажа. Из выросшей культуры готовили водную суспензию - 1 млрд клеток/мл, рассевали на питательную среду бобовый агар в чашки Петри и помещали в холодильную камеру. Посев инкубировали 12-15 дней при температуре 8-10°С. Было проведено последовательно 10 пассажей с последующим инкубированием в тех же условиях, затем отбирали максимальные по величине колонии, которые размножали и в дальнейшем использовали для проверки их симбиотических свойств при инокуляции семян гороха. Температурный режим, время инкубации и количество пассажей подбирали экспериментально, как наиболее эффективные для получения клубеньковых бактерий, растущих при пониженных плюсовых температурах. Для дальнейшей работы был отобран клон предлагаемого штамма. Пример 2. Эффективность предлагаемого штамма № 2636 проверяли в условиях вегетационных опытов в течение 1987-1990 гг. Вегетационные опыты проводили на речном мытом песке со смесью Гельригеля. Азот вносили в количестве 0,2 нормы. Использовали сосуды Вагнера обьемом 11 кг. Семена гороха сорта Смарагд перед посевом стерилизовали 70% спиртом, промывали стерильной водой, потом инокулировали штаммомстандартом и предлагаемым штаммом. Опыты проводили в 8-кратной по-вторности. Семена контрольных и опытных растений инокулировали суспензией клеток клубеньковых бактерий с титром 1 млрд/мл, приготовленных путем смыва 18-суточной культуры ризобий стерильной водопроводной водой по общепринятой методике. Стерильные семена выдерживали в суспензии бактерий в течение 2-х часов и высевали в сосуды при температуре 8-15°С. Абсолютным контролем служили неинокулирован-ные растения. Опыты проводили в камере ВКШ в вегетационном домике. В опытах изучали симбиотическую азотфиксацию, которую определяли по редукции ацетилена в этилен (Hardy R.W.F. Holstein R.D. Jackson Є.К„ Burns R.C. The acetylene-ethylene assay for N2 fixation: laboratory and field evaluation.-Plant Physiology. 1968,43, № 8, p. 11851207) массу растений, время образования клубеньков при температуре 8-10°С и урожай семян гороха на сосуд. Из данных табл. 1 и 2 видно, что предлагаемый штамм клубеньковых бактерий № 2636 отличается от штамма-прототипа более ранним образованием клубеньков, повышенной азотфиксирующей активностью и эффективностью. При инокуляции предлагаемым штаммом клубеньки на корнях гороха образовались на 5-6 дней раньше, чем при обработке штаммом-прототипом. В связи с более ранним образованием и функционированием клубеньков происходит увеличение периода активной азотфиксации. Более того, азотфиксирующая активность клубеньков гороха в варианте с инокуляцией предлагаемым штаммом в 1,5-2 раза выше, чем штаммом-прототипом. Как следует из данных таблиц инокуляция семян штаммом № 2636 увеличивает урожай зерна на 21% и зеленой массы на 8%. Пример 3. Эффективность предлагаемого штамма и штамма-прототипа в полевых условиях проверяли в течение 1988-1992 гг. Для этого предлагаемый № 2636 штамм выращивали на питательной среде (бобовый агар с сахарозой) при 8-10°С в пробирках в течение 12-14 суток, затем смывали стерильной водой с агара и готовили густую суспензию, которой засевали матрацы с бобовым агаром (объем 1:5 л), инкубировали 3-5 суток при 26°С. После инкубации культуру смывали 50 мл стерильной воды и вводили инокулят шприцом в стерильный торф (200-300 г/га) и хорошо перемешивали. Приготовленный таким образом ризоторфин помещали в термостат при температуре 26°С на 3-5 суток. После инкубации проверяли титр клубеньковых бактерий, который составил 5x108 клеток на 1 г торфа и инокулировали семена гороха. Для этого гектарную норму семян увлажняли (1-2% от массы семян) и равномерно перемешивали с ризоторфи-ном, приготовленным на предлагаемом штамме и производственном (штамм 250а -прототип), подсушивали в тени и высевали в почву. Абсолютным контролем был вариант без инокуляции. Полевые опыты проводили в хозяйствах, расположенных в зоне Лесостепи Украины (с. Зеленьки Мироновского района на типичном черноземе, малогумусном 3,5%, рН 6,7 и с. Глеваха Васильковско-го района Киевской области), где преобладают светло-серые оподзоленные, легко-суглинистые почвы с рН 6,0-6,7, содержание гумуса 1,61,7%, азот 13,6мг/кг, Р2O5 - 56,6 мг/кг, К2О -134 мг/кг. Полевые опыты проводили в 4-х кратной повторности, площадь делянки 5 кв.м. Растения гороха сорта Смарагд, Неосыпающийся, богатырь чешский, Солара высевали в севообороте после сахарной свеклы, удобрений и пестициды не вносили. В полевых условиях опытов 1988 г. сорт гороха Неосыпающийся выявлено увеличение нитрогеназной активности клубеньков при инокуляции предлагаемым штаммом ,№ 2636 в 1,5-2 раза по сравнению со штаммом-прототипом, что способствует повышению урожая зерна на 22% по сравнению с абсолютным контролем и на 17% по сравнению со штаммом-прототипом (табл. 3). Как свидетельствуют данные табл. 4 в полевых условиях 1992 г. инокуляция семян гороха сорта Солара способствует увеличению азотфиксирующей активности, увеличивает урожай зерна на 9,5 ц/га. Особенно следует отметить положительное влияние инокуляции предлагаемым штаммом № 2636 на содержание белка в зерне. Как следует из табл. 4 содержание белка увеличилось на 5,2% по сравнению с инокуляцией штаммом-прототипом и на 5,3% против неиноку-лированного контроля. Таким образом, в результате многолетних исследований установлено, что в услови-ях Лесостепи Украины, предлагаемый штамм № 2636 на многих сортах гороха способствует увеличению периода активной азотфиксации за счет более раннего образования клубеньков (на 5-6 суток раньше), чем штамм-прототип при температуре 8-12°С). Инокуляция предлагаемым штаммом № 2366 способствует увеличению азотфиксации в 2 раза по сравнению с штаммом-прототипом. Предлагаемый штамм клубеньковых бактерий гороха имеет повышенную эффективность по сравнению с прототипом, положительно влияет на увеличение урожая зерна гороха, содержание белка в зерне. Это дает возможность получения экологически чистой продукции за счет симбиотрофного питания гороха атмосферным азотом без внесения минерального азота в почву. Предлагаемый штамм № 2636 испытывали в течение трех лет в Географической сети опытов при ВНИИСХМ. По данным Географической сети опытов (табл. 5) видно, что из 14 опытов в 11 случаях прибавка урожая, которую обеспечивал предлагаемый штамм, выше чем прибавка урожая от испытанного производственного штамма № 250а. Штамм Rhizoblum legumlnosarum № 2636 рекомендован Межведомственной комиссией Географической сети опытов для использования в качестве производственного штамма.