Спосіб прогнозування негативного впливу наночасток срібла на організм

Спосіб прогнозування негативного впливу наночасток срібла на організм, що включає введення наночасток срібла та їх дослідження в біологічних об'єктах, який відрізняється тим, що після введення наночасток срібла виділяють тотальні РНК із печінки, легень, серця, нирок та головного мозку щурів з подальшим проведенням полімеразної ланцюгової реакції комплементарних ДНК (кДНК), виявляють зміни в експресії протеїнкінази SNARK і за змінами рівнів експресії прогнозують негативний вплив наночасток срібла на організм та ймовірність патологічних станів. (19) (21) u201008484 (22) 07.07.2010 (24) 10.11.2010 (46) 10.11.2010, Бюл.№ 21, 2010 р. (72) ЯВОРОВСЬКИЙ ОЛЕКСАНДР ПЕТРОВИЧ, МІНЧЕНКО ОЛЕКСАНДР ГРИГОРОВИЧ, МІНЧЕНКО ДМИТРО ОЛЕКСАНДРОВИЧ, БОЖКО ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА, ЗІНЧЕНКО ТЕТЯНА ОЛЕКСАНДРІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ 3 через біологічні бар'єри організму. Вважається, що наносрібло є довгостроковим джерелом іонів срібла, з чим пов'язують небезпеку його шкідливого впливу на довкілля [6]. Під час різних технологічних операцій синтезу наносрібла існує реальна можливість його надходження в організм інгаляційним шляхом. Наявні в літературі дані наукових досліджень переконливо свідчать про більш високу біологічну активність наночасток срібла порівняно з металевим сріблом. Проблема прогнозування токсичної дії наносрібла ускладнюється тим, що ще не встановлені високочутливі молекулярно-генетичні біомаркери, які б давали змогу попередити негативний вплив наночасток срібла при низьких його концентраціях. Прототипом до способу оцінки нанотоксичності є спосіб оцінки генотоксичних властивостей наноматеріалів на основі методу ДНК-комет. Суть способу полягає в проведенні електрофорезу в мікрогелях для детекції пошкоджень ДНК в окремих клітинах. Міграція ДНК до аноду тим більше, чим більше розривів містить ДНК [7]. Але даний спосіб не дає можливості проведення простого морфологічного аналізу пошкоджень ДНК та їх параметричної оцінки. Значна частина пошкоджень ДНК, що виявляються методом ДНК-комет, не може бути ідентифікована у результаті репарації ДНК. Спостерігається варіабельність результатів дослідження, що пов'язана з процесом підготовки препаратів і аналізом зображень. Задачею корисної моделі є вдосконалення способу оцінки токсичної дії наночасток, виявлення можливих молекулярних механізмів впливу наносрібла на живі організми для попередження негативних наслідків дії наносрібла на працівників та населення в цілому при різних технологіях виробництва та використанні наночасток срібла. Технічний результат, який одержують в результаті вирішення задачі, полягає у встановленні зміни експресії гена SNARK у життєво важливих органах щурів (печінці, легенях, нирках, головному мозку та серці), що може слугувати важливим чутливим показником дії на організм наночасток срібла. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі, що включає введення наночасток срібла та їх дослідження в біологічних об'єктах згідно корисної моделі після введення наночасток срібла виділяють тотальні РНК із печінки, легень, серця, головного мозку та нирок щурів з подальшим проведенням полімеразної ланцюгової реакції комплементарних ДНК (кДНК), виявляють зміни в експресії протеїнкінази SNARK і за змінами рівнів експресії прогнозують негативний влив наночасток срібла на організм та ймовірність патологічних станів. Спосіб здійснюється наступним чином: Тотальні РНК виділяють із печінки, легень, нирок, головного мозку, сім'яників та серця щурів з допомогою реагенту Трізол (Trizol; Invitrogen, USA) згідно протоколу виробника. Осаджують РНК рівним об'ємом 2-пропанолу. Осади РНК промивають 54571 4 двічі 75% етанолом і розчиняють у воді, що не містить домішок рибонуклеаз. Експресію мРНК протеїнкінази SNARK досліджують методом полімеразної ланцюгової реакції кДНК, отриманих шляхом зворотної транскрипції РНК, а також методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі. Для зворотної транскрипції використовують РНК із різних органів щурів як матрицю для синтезу кДНК, оліго(dТ) праймер та Superscript II зворотну транскриптазу (Superscript II Reverse Transcriptase, Invitrogen, США) і реакцію проводять згідно протоколу виробника. Для ампліфікації кДНК протеїнкінази SNARK використовують HotStarTaq Master Mix Kit (QIAGEN, Німеччина) та специфічні для цих генів щура пари праймерів. Для ампліфікації кДНК протеїнкінази SNARK використовують прямий (5’AAGTCTCGGCAGCGTGAATC -3') та зворотний (5’CAGGATGCTGTCCTCACTCA -3') праймери. Нуклеотидні залишки цих праймерів відповідають залишкам нуклеотидів 1544-1564 та 1737-1718 у послідовності мРНК протеїнкінази SNARK щура (GenBank номер NM_001007617). Ці пари праймерів використовуються для ампліфікації протеїнкінази SNARK також і в кількісній полімеразній реакції (у реальному часі). Для контролю кількості РНК досліджують експресію мРНК -актину. Експресія кожної смуги кДНК протеїнкінази SNARK порівнюється з експресією кДНК -актину. Продукти ампліфікації аналізують електрофорезом в 2% агарозному гелі, забарвлюючи кДНК бромистим етидієм. Аналіз результатів кількісної полімеразної ланцюгової реакції виконують за допомогою спеціальної комп'ютерної програми "Differential expression calculator", а статистичну обробку результатів в Excel програмі. Різницю між двома середніми величинами вважають достовірною при значенні р