Спосіб прогнозування негативного впливу наночасток срібла на організм

Спосіб прогнозування негативного впливу наночасток срібла на організм, що включає введення наночасток срібла та їх дослідження в біологічних об'єктах, який відрізняється тим, що після введення наночасток срібла виділяють тотальні РНК із печінки, легень, серця, нирок щурів з подальшим проведенням полімеразної ланцюгової реакції комплементарних ДНК (кДНК), виявляють зміни в експресії казеїнкінази-1ε і за змінами рівнів експресії прогнозують негативний вплив наночасток срібла на організм та ймовірність патологічних станів. (19) (21) u201008485 (22) 07.07.2010 (24) 10.11.2010 (46) 10.11.2010, Бюл.№ 21, 2010 р. (72) ЯВОРОВСЬКИЙ ОЛЕКСАНДР ПЕТРОВИЧ, МІНЧЕНКО ОЛЕКСАНДР ГРИГОРОВИЧ, МІНЧЕНКО ДМИТРО ОЛЕКСАНДРОВИЧ, БОЖКО ІРИНА ВОЛОДИМИРІВНА, ЗІНЧЕНКО ТЕТЯНА ОЛЕКСАНДРІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ 3 Наявні в літературі дані наукових досліджень переконливо свідчать про більш високу біологічну активність наночасток срібла порівняно з металевим сріблом та про необхідність дослідження його впливу на рівні експресії генів регуляторних факторів, що контролюють протікання багатьох метаболічних процесів. Проблема прогнозування токсичної дії наносрібла ускладнюється тим, що ще не встановлені високочутливі молекулярно-генетичні біомаркери, які б давали змогу попередити негативний вплив наночасток срібла при низьких його концентраціях. Прототипом до способу оцінки нанотоксичності є спосіб оцінки генотоксичних властивостей наноматеріалів на основі методу ДНК-комет. Суть способу полягає в проведенні електрофорезу в мікрогелях для детекції пошкоджень ДНК в окремих клітинах. Міграція ДНК до аноду тим більше, чим більше розривів містить ДНК [9]. Але даний спосіб не дає можливості проведення простого морфологічного аналізу пошкоджень ДНК та їх параметричної оцінки. Значна частина пошкоджень ДНК, що виявляються методом ДНК-комет, не може бути ідентифікована у результаті репарації ДНК. Спостерігається варіабельність результатів дослідження, що пов'язана з процесом підготовки препаратів і аналізом зображень. Задачею корисної моделі є вдосконалення способу оцінки токсичної дії наночасток, виявлення можливих молекулярних механізмів впливу наносрібла на живі організми для попередження негативних наслідків дії наносрібла на працівників та населення в цілому при різних технологіях виробництва та використанні наночасток срібла. Технічний результат, який одержують в результаті вирішення задачі, полягає у встановленні зміни експресії казеїнкінази-1 у життєво важливих органах щурів (печінці, легенях, нирках та серці), що може слугувати важливим чутливим показником дії на організм наночасток срібла. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі, що включає введення наночасток срібла та їх дослідження в біологічних об'єктах згідно корисної моделі після введення наночасток срібла виділяють тотальні РНК із печінки, легень, серця, та нирок щурів з подальшим проведенням полімеразної ланцюгової реакції комплементарних ДНК (кДНК), виявляють зміни в експресії казеїнкінази-1 і за змінами рівнів експресії прогнозують негативний вплив наночасток срібла на організм та ймовірність патологічних станів. Спосіб здійснюється наступним чином: Тотальні РНК виділяють із печінки, легень, міокарду, нирок та щурів з допомогою реагенту Трізол (Trizol; Invitrogen, USA) згідно протоколу виробника. Осаджають РНК рівним об'ємом 2пропанолу. Осади РНК промивають двічі 75% етанолом і розчиняють у воді, що не містить домішок рибонуклеаз. Експресію мРНК казеїнкінази-1 досліджують методом зворотної транскрипції матричних РНК та полімеразної ланцюгової реакції отриманих при цьому комплементарних ДНК (кДНК), а також методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції 54572 4 (у реальному часі). Тотальну РНК із різних органів щурів використовують як матрицю для синтезу кДНК з допомогою оліго(dТ) праймера та SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, США) згідно протоколу виробника. Для ампліфікації кДНК казеїнкінази-1 використовують HotStarTaq Master Mix Kit (QIAGEN, Німеччина) та специфічні для цього гену щурів пари праймерів. Для ампліфікації кДНК казеїнкінази-1 використовують такі праймери: прямий 5'GACATCTACCTGGGTGCCAAC-3' та зворотний 5'TGATCATCTGGTCGGCCAGC-3', нуклеотидні послідовності яких відповідають залишкам нуклеотидів 64-84 та 340-321, відповідно, в мРНК казеїнкінази-1 щура (GenBank номер NM_031617). Праймери: прямий -5'CTGGGAAGATCCTGTACATC-3' та зворотний 5'GCTGGTAGCGAATCTCATTC-3', нуклеотидні послідовності яких відповідають залишкам нуклеотидів 700-719 та 960-941 використовуються для ампліфікації казеїнкінази-1 при дослідженні її експресії методом кількісної полімеразної ланцюгової реакції. Для контролю кількості аналізуємої РНК досліджують експресією мРНК -актину. Експресія кожної смуги кДНК казеїнкінази-1 порівнюють з експресією мРНК -актину. Продукти ампліфікації аналізують електрофорезом в 2% агарозному гелі, забарвлюючи кДНК бромистим етидієм. Аналіз результатів кількісної полімеразної ланцюгової реакції виконують за допомогою спеціальної комп'ютерної програми "Differential expression calculator", а статистичну обробку результатів в Excel програмі. Різницю між двома середніми величинами вважається достовірною при значенні р