Спосіб скринінгу лікарських препаратів

1 Спосіб скринінгу лікарських препаратів для конкретного хворого, згідно з яким культивують компоненти крові хворого з препаратами, що тестуються, аналізують компоненти крові після культивування і вибирають оптимальний препарат, який відрізняється тим, що культивують препарат з цільної гепаринізованої крові хворого, введення препарату, що тестується, в кров здійснюють у дозі, що відповідає 1 5000 від терапевтичної та шуканий вибирають препарат з найбільшим співвідношенням -SH і -SS- груп у КЛІТИННІЙ фракції у конкретного хворого 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що культивування проводять протягом 1 години при температурі 37°С Винахід стосується медицини, а саме способів скринінга лікарських препаратів, а саме підбору препарату і його оптимальної дози для лікування конкретного хворого В даний час традиційний підбір препарату для конкретного хворого включає в себе клінічне обстеження хворого, зіставлення даних обстеження з рекомендаціями фармації, призначення препарату або групи препаратів і корекція призначення за результатами впливу препарату на організм (Методы экспериментальной химиотерапии Практическое руководство , под ред Першина Г Н , М , 1971, с 234) Однак тривалість і ненадійність підбору методологи лікування для конкретного хворого, висока роль суб'єктивного підходу примушує шукати нові більш об'єктивні методи підбору препаратів та їх дозування для конкретного хворого конкретним захворюванням Відомий метод скринінга лікарських препаратів для конкретного пацієнта, що включає в себе розміщення рук оператора над хворим і речовинами, що тестуються, і тестування оптимального препарату виходячи з температурної реакції оператора (патент РФ №2007117, 1992, кл А61В 5/04) Цей метод носить досить універсальний характер, однак для нього також характерна визначена суб'єктивність і недостатня надійність результатів ВІДОМІ методи скринінга лікарських препаратів для лікування окремих патолопй - захворювань ЦНС, вірусних, онкологічних і інших захворювань (пат і авт ев РФ №1806601, 1990, кл А61В 5/0476, №1540804, 1987, кл А61В 10/00, №2000739, 1991, кл А61В 5/02, №2046341, 1994, кл G01N 33/48) В основі методів лежить введення препаратів, що тестуються, в організм або в контакт з препаратами тканин або рідин організму, виявлення значимих характеристик, вимір параметрів цих характеристик для кожного препарату, що тестується, і вибір як оптимального препарату засобу, що оказує максимальний вплив на обрані характеристики Однак ці методи мають досить обмежене застосування і не дозволяють одержати досить надійні результати у випадку необхідності проведення комплексної терапії Відомий спосіб вибору дози лікарського препарату для лікування серцевосудинної недостатності, в якому проводять хемілюмінесцентний аналіз венозної крові після и інкубації з розчинами препарату різної концентрації і вибирають в якості цільової дозу препарату, що забезпечує мінімальну активність хемілюмінесценції (патент РФ №2072100 С1, 20 01 97) Даний спосіб також має вузький спектр застосування Завданням винаходу є створення більш швид О 1 Ю 57177 кого й універсального способу скринінгу лікарських лин центрифугують для осадження зруйнованих препаратів клітин протягом 15хв при бОООоб/хв Надосадову рідину (гемолізат) використовують у роботі У поДля вирішення цього завдання було запропосудину для титрування (бюкс, скляна чашка на ЗО новано проводити скринінг на основі результатів 40мл) вносять 25 - ЗОмл аміачного буфера Помікультивування проби цільної гепаринізованої крові щають посудину на магнітну мішалку, занурюють у хворого з водними розчинами препаратів, що тесдосліджуваний розчин платиновий електрод і вільтуються, у різних дозах, визначення співвідношенний кінець сольового містка, вмикають у мережу ня -SH і -SS- груп у КЛІТИННІЙ фракції крові хворого мікроамперметр, опускають у центр посудини каппісля культивування і вибирають в якості оптимасулу з магнітом і починають її обертання зі швидкільного препарату або оптимальної дози препарат, стю, що виключає розбризкування розчину Дозащо забезпечує найбільше співвідношення -SH і тором відмірюють у посудину 0,2мл гемолізату SS- груп у КЛІТИННІЙ фракції крові хворого Після ТОГО, ЯК стрілка мікроамперметра прийме (При виборі препарату призначення слід вихостабільне положення починають титрування, додити з того, що, як показали проведені експериме3 даючи по 0,05 (0,1) мл 1 10 М розчини AgNO3 нти, оптимальний препарат в оптимальній дозі для Після кожної чергової порції чекають, щоб стрілка лікування даного хворогодає зазначене співвідзупинилася, відзначають відповідне її положенню ношення близько 3,0) число ПОДІЛІВ шкали і продовжують титрування По Культивування крові проводять, як правило досягненні кінцевої його точки перша ж чергова протягом 1 години при температурі, максимально порція титранту викликає помітний стрибок сили близькій до 37°С, причому введення препарату, струму і відхилення стрілки на більшу, ніж раніше, що тестується, в кров здійснюють у дозі, що відповеличину Зробивши після цього ще 4 - 5 вимірів, відає 1 5000 від терапевтичної титрування припиняють, і за його результатами В основу способу була покладена гіпотеза про графічним способом знаходять КІЛЬКІСТЬ нітрату те, що сірковміщуючі компоненти крові є найбільш срібла, витраченого на титрування розчину, на чутливими до впливу на організм факторів різної базі чого розраховують вміст SH-rpyn етіології, зв'язаних із захворюваннями організму, і, отже, препарати, здатні їх нормалізувати є найПри зворотному амперометричному титруванбільш ефективними для лікування ні в посудину для титрування наливають 25мл аміачного буфера, ставлять його на поверхню маОсновними ВІДМІННОСТЯМИ заявляемого спосогнітної мішалки, занурюють у розчин індикаторний бу від прототипу є використання для культивуванелектрод і кінець сольового містка від електрода ня цільної крові, визначення нового параметра порівняння, вмикають у мережу мікроамперметр і співвідношення -SH і -SS- груп у КЛІТИННІЙ фракції магнітну мішалку, пускають її, і при безперервному крові і визначення оптимального параметру стану перемішуванні послідовно вносять у буферну суДо 1мл цільної гепаринізованої крові, взятої з міш наступні реагенти 0,5мл 1 10 М розчину периферичної вени додають препарати, що тесАдІЧОз, 0,2мл гемолізату, 200мг сульфіту натрію туються, в необхідних дозах (дозування in vitro розраховується виходячи з 1 5000 від терапевтичВмикають мікроамперметр і після того, як стріної), у контрольну пробірку додається розчинник, лка прийме стабільне положення (приблизно чесуміші шкубують 1 годину при температурі близько рез 3 - 5 хвилин), починають титрувати досліджу37°С Можливе продовження строку культивуванвану пробу 5 10 4 М розчином унітюлу, додаючи ня до 2 годин, що дозволяє трохи підвищити точйого в реакційну суміш по 0,05мл (або по 0,1 мл) до ність способу, однак цей прийом доцільно викорикінцевого об'єму 0,5мл Після завершення титрустовувати тільки при близькості результатів тестування КІЛЬКІСТЬ унітюлу, витраченого на титруванвання різних препаратів або при слабкому впливі ня проби визначають графічним способом, а потім препаратів на співвідношення -SH і -SS- груп на основі цієї величини розраховують КІЛЬКІСТЬ SSгруп, після чого розраховують відношення конценКІЛЬКІСТЬ -SH, -SS- груп і їх співвідношення в трації SH-rpyn до концентрації SS-rpyn КЛІТИННІЙ фракції крові визначають, в основному, методами прямого (-SH), і 3BopoTHoro(-SS) ампеЯк правило, зазначені способи суміщають між рометричного титрування собою Після визначення змісту SH-rpyn вищеописаним способом прямого титрування не перериПри прямому амперометричному титруванні ваючи перемішування розчину, вносять у посудину кров з вени (Юмл) вносять у пробірку, яка містить для титрування сульфіт натрію і зворотним титруантикоагулянт (1 - 2 краплі гепарину, 1мл якого ванням за допомогою еквімолярного розчину унітімістить 5000МЕ) Потім кров розливають по 1мл у олу визначають у тій же пробі вміст SS-rpyn При необхідну КІЛЬКІСТЬ пробірок (звичайно 7 - 9), яка цьому надлишковий розчин срібла для зворотного залежить від КІЛЬКОСТІ препаратів, що тестуються, титрування вносять у реакційну суміш не однократа їх доз У кожну пробірку додають препарати, що тно, а окремими порціями в процесі прямого титтестуються, в необхідних дозах (дозування in vitro рування розраховується виходячи з 1 5000 від терапевтичної), у контрольну пробірку додається розчинник, Можливість застосування заявляемого спососуміші шкубують у термостаті 1 годину при t = бу скринінгу препаратів для лікування захворю37°С Після інкубації пробірки центрифугують 5 - 7 вань різної етіології демонструється наступними хвилин при 800об/хв , після чого плазму видаляприкладами ють Потім клітинну фракцію крові гемолізують у Приклад 1 Хвора Б-я Е В поступила з діагно0,1% розчині Трилону «Б» (рН = 7,0) 1 частина зом рак поперечно-ободочної кишки, T3N0M0, викоклітин крові і 19 частин розчину змішують, помінана радикальна операція - резекція поперечнощають у холодильник (+4°С - +5°С) і через ЗО хвиободочної кишки Було проведене дослідження по заявляємій методиці впливу різних доз протипухлинного та імуномодулюючого препарату україн («Nowicky Pharma», Австрія) і антиппоксанту оліфену (ТзОВ «Корпорація Оліфен») на стан тюлдисульфідної рівноваги крові, результати якого представлені в таблиці Оптимальним препаратом, за нашими оцінками, був україн у дозі 5,0мг на введення (при додаванні украіна в цій дозі -SH/-SS- коефіцієнт підвищився з 2,00 до 3,00) Хворій був проведений 1 курс лікування украіном до операції і 2 - після оперативного лікування з використання украіна в дозі 5,0мг на введення через день (10 введень на 1 курс) При гістологічному дослідженні видаленої пухлини залозистий рак з ослизненням у просвіті залоз, некрозами, запальним інфільтратом у стромі До цього часу протягом трьох років зберігається повна ремісія захворювання і нормальні показники вмісту раково-ембріонального антигену (PEA) у сироватці крові (27 12 96 - 1,2нг/мл, 10 04 97 1,1нг/мл, при нормі до 5нг/мл) Приклад 2 Хвора Г-ва Н В поступила з діагнозом рак поперечно-ободочної кишки, T4N2M1, була проведена резекція пухлини з приводу кишкової непрохідності, у ході операції виявлений канцероматоз очеревини Проводилося вивчення впливу украіна і реаферона (НПО «Вектор», Новосибірська обл) на стан тюлдисульфідної рівноваги крові (таблиця) Оптимальним препаратом, за нашими даними, був україн у дозі 10,0мг на введення (при додаванні украіна в цій дозі -SH/-SS- коефіцієнт підвищився з 1,17 до 1,75) Проведено курс лікування в дозі 10,0мг украіна внутрішньовенно через день (10 ІН'ЄКЦІЙ) ПІСЛЯ першої ж ін'єкції була відзначена характерна реакція на введення препарату, що свідчить про ефективність терапії підвищення температури тіла до 37,9°С, ПІТЛИВІСТЬ При продовженні терапії реакція слабшала і до кінця курсу лікування стала мінімальною Суб'єктивно було відзначено значне поліпшення самопочуття хворої, а при лабораторних дослідженнях - нормалізація змісту PEA в сироватці крові (9 12 96 - 1,7нг/мл, а 27 12 96 - 1,3нг/мл) Надалі хворій було проведено ще 2 курси лікування украіном, при цьому була відзначена стабілізація пухлинного процесу протягом 8 МІСЯЦІВ Приклад 3 Хвора Л-н Е А поступила з діагнозом рак лівої молочної залози, T3N2M1, з метастазами в хребет (Thi2, Li 2), стан після мастектомм Отримала курс променевої терапії на хребет, 4 курси хіміотерапії, бонефос При дослідженні впливу украшу й оліфену на тюлдисульфідну рівновагу крові (таблиця) відзначено, що у даної хворої на всіх дозах препаратів відзначалися низькі показники коефіцієнта -SH/SS-, оптимальним препаратом був україн у дозі 5,0мг на введення (при додаванні украіна в цій дозі -SH/-SS- коефіцієнт підвищився з 1,00 до 1,67) Однак, ВІДПОВІДНО до загальноприйнятих правил у даному випадку було проведене лікування украіном у дозі Юмг на введення внутрішньовенне через день (10 ІН'ЄКЦІЙ) ПІСЛЯ курсу терапії 57177 стан хворої суттєво не покращився, зберігався больовий синдром, вміст онкомаркера СА 15-3 трохи підвищився (14 01 97 - 38,ЗЕД/мл, 04 02 97 42,6ЕД/мл, при нормі до 26,9ЕД/мл), а надалі захворювання продовжувало швидко прогресувати Приклад 4 Хвора А-ва Ш О , 59 років поступила з діагнозом рак стравоходу, T2NxMo, проведена променева терапія При дослідженні впливу украшу і циклоферону (індуктор інтерферону, НТФФ «Полісан») на стан тюлдисульфідної рівноваги встановлено, що оптимальний ефект давав україн у дозі 5,0мг (при додаванні украша в цій дозі -SH/-SS- коефіцієнт підвищився з 0,93 до 2,50) Проведено 2 курси лікування украшом у дозі 5,0мг через день (10 ІН'ЄКЦІЙ) Перед першим і другим курсами терапії вміст онкомаркерів був у нормі, при цьому після проведення другого курсу терапії украшом відзначено зниження вмісту СА 19-9 (24 0197 вміст PEA - 0,53нг/мл, СА 19-9 5,0ЕД/мл, ЗО 12 98 вміст PEA - 0,80нг/мл, СА 19-9 23,9ЕД/мл, 27 01 99 СА 19-9- 18,1ЕД/мл при нормі до 37ЕД/мл) До цього часу протягом трьох років у хворої відзначається стабілізація процесу, за даними фіброгастродуоденоскопм (22 12 98) - виразка нижньої третини стравоходу (виразковий дефект 0,3 х 0,5см під фібрином), ерозивный езофапт, при УЗД черевної порожнини даних про генералізацію процесу не одержано Приклад 5 Хвора Д-ва С В поступила з діагнозом неходжкинська лімфома шлунка (пролімфоцитарна), T3N2M0, проведена субтотальна резекція шлунка по Більрот-2 При гістологічному дослідженні вилученої пухлини - пролімфоцитарна лімфома, в лімфовузлах великої і малої кривизни шлунка аналогічна гістологічна картина При дослідженні впливу украшу й оліфену на тюлдисульфідну рівновагу крові (таблиця) відзначено, що у даної хворої оптимальним препаратом був оліфен у дозі 0,5г на введення (при додаванні оліфена в цій дозі -SH/-SS- коефіцієнт підвищився з 2,00 до 3,12) Проведено 3 курси лікування оліфеном по 1 таблетці (0,5г) 3 рази на день протягом 1,5 МІСЯЦІВ з перервами 2 - 3 МІСЯЦІ Протягом 5 років у хворої зберігалася повна клшіко-гематолопчна ремісія захворювання Приклад 6 Хворий К-н А В поступив з діагнозом хронічний вірусний гепатит В без дельтаагента (вірусу) При дослідженні впливу реаферона і циклоферона на тюлдисульфідну рівновагу крові (таблиця) відзначено, що в даного хворого оптимальним препаратом був реаферон у дозі 1млн ME на введення (при додаванні реаферона в цій дозі SH/-SS- коефіцієнт підвищився з 1,52 до 3,07) Проведено курс лікування реафероном по 1млн ME внутрішньом'язово через кожні 3 дні протягом 6 МІСЯЦІВ В результаті проведеної терапії відбулася нормалізація активності АлАТ і АсАТ, реверсія ДНК HBV, HBeAg і HBsAg, зберігається стабільна ремісія протягом 8 МІСЯЦІВ Приклад 7 Хвора П-ва Г А поступила з діагнозом - ревматоїдний поліартрит з поразкою плечових, ліктьових, променезап'ясткових, п'яснофалангових і міжфалангових суглобів, тазостегно 8 57177 вих суглобів, суглобів гомілок і стоп, сірконегативний, швидко прогресуючий перебіг, 2-а ступінь активності, функціональна здатність хворої - З При дослідженні впливу оліфену і циклоферону на тюсульфідне співвідношення в крові (таблиця), виявилося, що для даної хворої оптимальним препаратом виявився циклоферон у разовій дозі 0,25м (при додаванні циклоферону в цій дозі співвідношення SH/SS підвищилося з 1,24 до 2,56) Проведено курс лікування циклофероном по 2мл 2% розчину внутрішньом'язово за схемою в 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 і 20 дні В результаті проведеної терапії вже на 5-й день від початку терапії вдалося знизити дозу ібупрофену з 3 (0,6г) до 2 (0,4г) таблеток на день, на 10-й день до 1 (0,2г) таблетки, а до 16 дня повністю відмовитися від прорізу анальгетиків у зв'язку зі зменшенням больового синдрому, значно підвищилася рухова активність хворої, за лабораторними даними СОЕ зменшилося з 39 до 24мм/годину, а С-реактивний білок понизився з ++ до + Таблиця Вплив лікарських препаратів на співвідношення SH/SS у культивуєміи фракції крові хворого Препарат Контроль Україн, мг Оліфен, г Реаферон, млн ME Циклоферон, г доза 0 0,5 2,5 5,0 10,0 0,05 0,15 0,5 1,0 0,5 1,0 3,0 6,0 0,25 0,5 1 2,00 2,29 2,00 3,00 1,75 1,89 2,17 2,83 2,51 Співвідношення SH/SS 2 3 1,17 1,00 1,00 1,45 0,50 1,14 1,27 1,67 1,75 1,38 1,22 1,10 1,35 1,51 1,25 1,50 1,08 1,03 Як показали проведені експерименти, пропонований спосіб є досить універсальним, дозволяючи тестувати препарати для лікування онкологіч Комп'ютерна верстка Е Гапоненко в крови для різних прикладів 4 5 6 0,93 2,00 1,52 1,42 2,28 1,20 2,55 2,50 2,16 2,00 2,11 2,35 2,77 3,12 2,86 2,53 3,07 2,14 1,79 1,57 2,14 1,94 2,66 7 1,24 1,45 1,39 0,93 1,12 2,58 2,18 них, вірусних, аутоіммунних і інших захворювань Строк скринінга оптимального препарату і його дози складає 2 - 3 години Підписано до друку 05 07 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна