Спосіб стимуляції антиоксидантного захисту і підвищення рівня приживлення ембріонів в ранній період вагітності

Спосіб стимуляції антиоксидантного захисту і підвищення рівня приживлення ембріонів в ранній період вагітності, який включає введення селеновмісних препаратів, який відрізняється тим, що 3 органічних сполук розкладаються або утворюють комплекси, що важко засвоюються [2086645 Патент Российской Федерации C12N1/16 Способ получения препарата, обогащенного селеном /Исакова Е. П.; Градова Н. Б.; Ерошин В. К.; Белов А. П.; Шерова Т. Л.; Горпенко Л. В.; Жильцова Т. С. № 93056583/13. Заявл. 21.12.1993. Опубл. 10.08.1997]. Іншим недоліком даних препаратів є те, що для виготовлення селенпротеїнових комплексів потрібно дороге устаткування та матеріальні затрати. Вводяться ж вони аналогічно до преміксів per os - тобто шляхом споживання з їжею, що не забезпечує максимального продуктивного та економічного ефекту. Відома висока ефективність введення селенвмісних препаратів саме парентеральним способом [Лодяной М. С. Влияние селенопирана на физиологическое состояние и неспецифическую резистентность стельных коров и новорожденных телят: дис. ... канд. биол. наук : 03.00.13 /Лодяной, Михаил Сергеевич. - Н. Новгород, 2007 - 126 с.]. Недоліком цього способу є відсутність досліджень із застосування селенопірану проведених при синхронізації охоти у щурів. Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, є застосування препарату селену з крохмалем, який передбачає оральний спосіб його введення у вигляді преміксу на основі мінеральних солей [2009646 Патент Российской Федерации А23K1/16 Кормовая добавка для пушных зверей "Пушновит n" № 5043014/15. Заявл. 14.05.1992. Опубл. 30.03.1994]. Недоліком цього способу є оральний спосіб введення препарату селену з крохмалем у вигляді преміксу з іншими мінеральними солями та розкладання препарату при зберіганні з утворенням комплексів, що важко засвоюються. Заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипу і завдяки способу застосування нового селеновмісного препарату та періоду його введення до синхронізації охоти лабораторних щурів фолікулостимулюючим гормоном (ФСГ) та хоріогогічним гормоном (ХГ) забезпечує підвищення антиоксидантного захисту організму, зростання рівня запліднення та зниження загибелі ембріонів в ранній період вагітності. Суть корисної моделі і суттєві ознаки В основі корисної моделі поставлено завдання - завдяки підвищенню рівня антиоксидантного захисту організму забезпечити при синхронізації охоти препаратом ФСГ та ХГ зростання заплідненості та зниження загибелі ембріонів у ранній період вагітності, який би був економічно вигідним, доступним і придатним до застосування у біотехнологічних центрах для підвищення кількості імплантацій у лабораторних тварин. За допомогою селену та його сполук в організмі здійснюється біосинтез імуноглобулінів, особливо типу G, відбувається корекція клітинних компонентів імунітету, зростає кількість хелперів (CD4) та зменшується кількість супресорів (CD8) у зв'язку з чим нормалізується індекс імунорегуляції. Крім того, активна роль селену та його органічних сполук у здійсненні антиоксидантних процесів при 57738 4 зводить до нормалізації клітинного дихання та відновлення метаболічно важливих енергетичних процесів [Dong, Y. Characterization of the biological activity of (-glutamyl-Se-methylselenocysteine: A novel, naturally occurring anticancer agent from garlic /Dong, Y, D. Lisk, E. Block [et al.] //Cancer Rescue. 2001. - Vol. 61. - P. 2923-2928.]. Технічний результат досягається введенням тваринам гелеподібного селенвмісного препарату, який містить 15 мкг селеніту натрію депонованого 2 %-им розчином крохмалю шляхом наступної термічної обробки при 90-95 °С впродовж 5-10 хвилин, який вводиться підшкірно в дозі 1 см3/гол три рази через два дні і після чого викликають синхронізацію охоти лабораторних самиць щурів фолікулостимулюючим гормоном в дозі 1-3 мкг/гол та хоріогонічним гормоном - 3-5 мкг/гол і через день спаровують з самцями. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю суттєвих ознак корисної моделі, яка заявляється і технічним результатом є наступний: - проведення ін'єкцій гелеподібного селенвмісного препарату, депонованого 2 %-ним розчином крохмалю в організмі самиць створюється тимчасове депо селену, з якого цей елемент поступово всмоктується протягом 2 діб по мірі того як крохмаль розщеплюється амілазою; - введення в організм самиць додаткової кількості екзогенного селену активізує всі ланки антикосидантного захисту: процеси перекисного окислення ліпідів та ферменти - глутатіонпероксидазу, каталазу та глутатіонредуктазу; - довготривале введення селенвмісного препарату - три рази через два дні та наступне викликання синхронізації охоти у самиць щурів ФСГ і ХГ та спарування із самцями забезпечує підвищення інтенсивності антиоксидантних процесів в зонах нідації ембріонів та їх приживлення. Відомості, що розкривають суть корисної моделі Проведенням патентно-інформаційного пошуку виявлено технічне рішення, в якому є ряд суттєвих ознак спільних із заявленим рішенням де препарат селену вводять у вигляді преміксів звичайним згодовуванням. Однак, наявність зазначених, спільних з прототипом ознак недостатня для отримання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак співпадали із заявленим способом в достатній патентній і науково-технічній інформації не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідальність заявленого технічного рішення критерію корисної моделі «Новизна». У джерелах патентної та науково-технічної інформації не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб стимуляції антиоксидантного захисту і підвищення рівня імплантації та кількості вагітних самок досягається введенням тваринам гелеподібного селенвмісного препарату, який містить 15 мкг селеніту натрію депонованого 2 %-им розчином крохмалю шляхом наступної термічної обробки при 90-95 °С впродовж 5-10 хвилин, який вводиться підшкірно в дозі 1 см3/гол три рази через два дні після чого викликають синхронізацію 5 охоти лабораторних самиць щурів ФСГ в дозі 1-3 мкг/гол та хоріогонічним гормоном 3-5 мкг/гол і через день спаровують з самцями. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про його відповідність критерію «винахідницький рівень». Даний спосіб може бути використаний у науково-біотехнологічних центрах у їх віваріях для підвищення рівня імплантації у лабораторних тварин та одержання більшої кількості приплоду, а тому відповідає критерію «промислова придатність». Таким чином заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає усім умовам патентоспроможності корисної моделі відповідно до статті 7 розділу II Закону України «Про охорону прав на винаходи і корисні моделі» № 1771-III, 2000 р. 4. Відомості, що підтверджують можливість здійснення корисної моделі 4.1. Приклад конкретного виконання Ефективність заявленого способу і його переваги в порівнянні з прототипом підтверджено науково-технічним дослідом, наведеним нижче. В експерименті використано 15 самиць лабораторних щурів лінії «Вістар» віком 6-7 місяців, які 57738 6 утримувались на стандартному раціоні. Було сформовано 3 групи тварин по 5 голів в кожній. Перша група була контрольна (табл. 1.), дослідна група 1 отримувала підшкірно селенвмісний препарат 3 рази через два дні (до запліднення), дослідна група 2-5 разів через два дні (до запліднення 3 рази і 2 після запліднення). Селенвмісний препарат з метою забезпечення пролонгованої дії вводили підшкірно в дозі 1 см3/гол. Він складався з селеніту натрію в дозі 15 мкг на щура, депонованого 2 %-им розчином крохмалю шляхом наступної термічної обробки при 90-95 °С впродовж 5-10 хвилин. Всі групи тварин оброблялись гормонами для стимуляції статевої охоти за стандартною схемою: ФСГ 20 МО на 1 самицю (препарат «Фолімаг», Мосагроген), через 48 годин хоріогонічний гормон (препарат ПРЕГНИЛ®, Organon). Підсадку самців проводили через 2-3 години після введення хоріогонічного гормону. Через 24 години перевіряли наявність копулятивних корків. При виявленні корків вважали цей день днем запліднення. На 9-й день після запліднення (імплантація у щурів відбувається на 7-7,5 день вагітності) самок забивали шляхом декапітації після передозування ефірного наркозу. Таблиця 1 Схема досліджень по застосуванню препарату селену на ранніх стадіях вагітності у лабораторних щурів при синхронізації охоти за стандартною схемою ФСГ з хоріогонічним гормоном, n=5 Введення селенвмісного препарату Гормональна обробка тварин Групи тварин Введення препарату Підсадка самців (2 Введення препарату хоріогонічного гормону самця на 5 самок) ФСГ через 48 год після введення ФСГ Через 3 години пісКонтрольна 20 МО на 1 самицю 30 МО на 1 самицю ля введення ХГ Через 3 години пісДослідна 1 20 МО на 1 самицю 30 МО на 1 самицю ля введення ХГ Через 3 години пісДослідна 2 20 МО на 1 самицю 30 МО на 1 самицю ля введення ХЧ Проводили морфометричну оцінку репродуктивних органів та візуально виявляли наявність зон імплантації. Результати фіксували фотокамерою. Рівень запліднюваності щурів вираховували за формулою: кількість спарованих/кількість запліднених X 100 %. Відбирали кров для визначення рівня активності глутатіонпероксидази, каталази та відновленого глутатіону. Визначення каталазної активності проводили за методом Королюк М. А. (1988). Глутатіонпероксидазну активність визначали за методом Моіна В. М. (1986). Вміст відновленого глутатіону визначали за методом Баталер, Дюпон, Келлі (1982) В місцях ін'єкцій препарату після забою самиць щурів не відмічено будь-яких зон почервоніння, інфільтрації або некрозу. В репродуктивних органах не виявлено суттєвої різниці між масою матки і яєчників у різних групах тварин. До запліднення Після запліднення 3 рази 3 рази 2 рази Встановлено, що найбільша кількість зон імплантацій у запліднених самок щурів виявляється у тварин першої дослідної групи, яким препарат селену вводили три рази через два дні до стимуляції охоти ФСГ та ХГ до запліднення. В другій дослідній групі кількість зон імплантацій дещо знижувалась. Підвищений вміст селену після запліднення негативно впливає на репродуктивну здатність тварин. Доказом доцільності такої схеми введення препарату є також наявність у самок дослідної групи 1 більшої кількості вагітностей. Оскільки глутатіонпероксидаза і каталаза є основними ферментами так званої глутатіонової антиоксидантної системи і підвищення їх активності у самок дослідної групи 1, які отримували препарат до запліднення, вказує, на посилення антиоксидантного захисту у щурів на ранніх стадіях вагітності. 7 57738 8 Таблиця 2 Результати морфологічної оцінки репродуктивних органів самок щурів та індексу вагітності за умов введення препарату селену при синхронізації охоти у щурів за стандартною схемою ФСГ з хоріогонічним гормоном, n=5 Контроль 0,97±0,164 Яєчники (вага в г) лівий правий 0,614±0,03 0,748±0,24 Дослідна 1 0,938±0,26 0,568±0,04 0,502±0,05 Дослідна 2 1,476±0,51 0,562±0,06 0,622±0,08 Групи тварин Матка (вага в г) За кількістю відновленого глутатіону ми прослідкували зміну активності ферменту глутатіонредуктази. З приведених даних видно, що найактивнішим цей фермент є у тварин також першої дослідної групи. При дослідженні активності ферментів та продуктів перекисного окислення ліпідів у тканинах виявлено, що першій дослідній групі, де індекс вагітності був вищий, в матці та серці достовірно зростає вміст як гідроперекисів так і малонового діальдегіду, а у тварин другої дослідної групи спостерігається одночасне зниження цих показників та індексу вагітності. При аналізі показників активності ферментів антиоксидантного захисту виявлено підвищення активності каталази та глутатіонпероксидази в матці, печінці та у сироватці крові тварин 1-ої дослідної групи. Моніторинг протікання процесів перекисного окиснення ліпідів показав, що у матці і печінці груп тварин з високим індексом вагітності (у контрольній та 1-й дослідній групі, яка отримувала підшкірно селенвмісний препарат 3 рази до запліднення, спостерігається найвищий рівень гідроперекисів ліпідів. Причому у 1-ій дослідній групі рівень гідроперекисів ліпідів зростав і в наднирниках, що пов'язано з підвищенням функціональної активності наднирників та посиленого синтезу стероїдних гормонів в цій групі. При аналізі показників кінцевого продукту перекисного окиснення ліпідів - малонового діальдегіда ми спостерігали зниження його вмісту в яєчни Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Стан репродуктивної систе- Індекс вагітноми самок щурів сті Виявлено 4 вагітних самки. 80 % Всі самки дослідної групи 100 % виявились вагітними. Виявлено 2 вагітних самки. 40 % ках та матці у всіх групах тварин, що вказує на позитивний вплив селену на антиоксидантний статус при становленні вагітності, але одночасно при цьому зростає вміст малонового діальдигіду у м'язах та нирках, що пояснюється стресом, який зазнає організм на ранніх стадіях вагітності. Особливо це видно в групах тварин, де індекс вагітності є високим - в контрольній та 1-й дослідній групі. Підвищення рівня малонового діальдигіду відображає активацію процесів перекисного окислення ліпідів. При моніторігну активності глутатіонпероксидази в різних органах ми спостерігали найвищий рівень його активності в матці у всіх групах тварин, при цьому цифрове значення найбільш виражене є у 1-й дослідній (індекс вагітності 100 %), а найменше у 2-й дослідній (індекс вагітності 40 %). Встановлено, що застосування селеновмісного препарату у щурів залишає активність аланінамінотрансферази та аспартатамінотрансферази у печінці і серцевому м'язі у всіх дослідних групах у межах фізіологічної норми, із збереженням їх функціональної активності. Спосіб забезпечує зростання динаміки формування ембріонально-маткового сигналу в зонах імплантації бластоцист, що позитивно впливає на зниження рівня доімплантаційної смертності та підвищення індексу вагітності, який досягає 100 % на відміну від звичайного 80 % в контролі. Синхронізація охоти у самиць щурів введенням ФСГ та ХГ на фоні активації всіх ланок антикосидантного захисту дозволяє отримати більшу кількість ембріонів та плодів. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601