Спосіб прискореної оцінки якості заморожено-відтаяної сперми бугаїв

Спосіб прискореної оцінки якості замороженовідтаяної сперми бугаїв, що включає інкубування зразка у біологічному ультратермостаті та періодичне визначення рухливості сперми, який відрізняється тим, що при інкубації використовується температура 45 °С, а інтервали часу між визначенням рухливості складають 10 хвилин. (19) (21) u201014999 (22) 13.12.2010 (24) 25.06.2011 (46) 25.06.2011, Бюл.№ 12, 2011 р. (72) САВЕЛЬЄВА МАРИНА СЕРГІЇВНА, СУШКО ОЛЕКСІЙ БОРИСОВИЧ (73) ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК УКРАЇНИ 3 Таким чином, з підвищенням температури інкубування з 38°С до 45°С, відбувається прискорення метаболічних процесів, що проходять в клітинах. На відміну від більш високих (47°С і вище) температур при гіпертермії 45°С не відбувається денатурації білків у клітині і миттєвої загибелі сперміїв, а лише наближується момент апоптозу (природної запрограмованої загибелі клітин). Такий підхід дає змогу диференціювати придатну до використання сперму від непридатної. При запропонованому способі оцінки якості сперми виконуються ряд маніпуляцій. Спермодозу (облицьовану) відтаюють при температурі 38°С. Для подальших маніпуляцій з зразком сперми використовують термостатований шприц (фіг. 1). Термостатований шприц складається з наступних елементів: зовнішній циліндр (1), внутрішній циліндр (2), поршень (3), кришка зовнішнього циліндра (4), манжета (5), корка внутрішнього циліндра (6). Порожнина між зовнішнім та внутрішнім циліндром заповнена водою (водяна сорочка) (7). Сперма (8) розміщується в порожнині шприца. Сперму набирають у попередньо підігрітий до температурі 45°С шприц. При натискуванні на поршень, краплина сперми наноситься на предметне скло та переноситься до мікроскопа з підігрівальним столиком для першої оцінки. Повертають шприц зі спермою до ультратермостата з температурою 45°C та через кожні 10 хвилин послідовно здійснюють оцінку якості сперми. При маніпуляціях термостатований шприц не дає змоги спермі охолоджуватись до кімнатної температури, коли біоматеріал виносять із ультратермостату для оцінки. Оцінка сперми здійснюється при 150-кратному збільшенні. При цьому в практичній роботі оцінка може бути як візуальною (тобто з певною похибкою, пов'язаною з суб'єктивним фактором) так і за допомогою програмного забезпечення, наприклад програми «SpermVision» [Aппаpaтно-Програмный Комплекс ВидеоТесТ-Сперм, регистр. удостовер. № 29/20010702/6102-04]. В першому випадку якість деконсервованого зразка сперми оцінюють у балах (10 % сперміїв з прямолінійно-поступовим рухом дорівнює 1 балу), у другому - у відсотках. При застосуванні запропонованого методу прискореної оцінки, придатна для подальшого використання сперма, повинна мати показник мінімальної виживаності 50 хвилин, що відповідає 5 годинам за стандартною методикою. Як додатковий комплексний показник може бути 60740 4 визначено показник абсолютної виживаності, який визначається за нижченаведеною формулою (1). Показник абсолютної виживаності визначений, за даною формулою при запропонованій методиці повинен становити не менше 6,0 умовних одиниць для деконсервованої сперми, придатної при подальшому використанні та штучному осіменінні корів і телиць. Sa=а0·Σа1·0,17+а2·0,17.....an·0,17 (1) де Sa - показник абсолютної виживаності а0 - рухливість сперми після деконсервації виражена в балах а1, а2, аn - активність сперми після інкубації при температурі 45°С через кожні 10 хвилин 0,17 - постійний коефіцієнт перерахунку з температури 45°С до температури 38°С * при визначенні рухливості у відсотках, слід зробити перерахунок в бали за формулою (2) абали=0,1·апроценти (2) Порівняльні випробування стандартного методу (найближчий аналог) і запропонованого показали, що він скорочує тривалість аналізу при визначенні за принципом альтернативності (придатна непридатна) в 6 разів, а при визначенні показників виживаності до повної загибелі сперміїв в середньому у 4,7 рази (таблиця 1). Нижче наведено графіки (фіг. 2), в яких показано динаміку зниження рухливості деконсервованих зразків сперми при інкубації за температури 38°С (найближчий аналог) та 45°С (запропонований метод). Випробування запропонованого способу оцінки заморожено-відтаяної сперми було здійснено та використовується на експериментальнометодичному племпідприємстві Інституту тваринництва УААН України, ДП «Сумському селекційному центрі». Перевірку деконсервованих зразків сперми, що попередньо були заготовлені за Харківською технологією асептичного отримання та кріоконсервації сперми бугаїв, що зберігалась в зрідженому азоті сперми бугаїв, проводили з використанням візуального методу та з застосуванням комп'ютеризованої системи Sperm Vision. Як показали випробування, запропонований спосіб є технологічним у виконанні. Він дозволяє протягом робочого дня провести перевірку значної кількості спермопродукції (біля 100 серій), та може застосовуватися на племпідприємствах в якості експрес-тесту. 5 60740 6 Таблиця 1 Придатність деконсервованої сперми до використань при штучному осіменінні за найближчим аналогом та запропонованим методах № бугая 850 8116 0061 137 065 0061 065 8116 137 0061 0061 850 (найближчий аналог) Придатність спеКличка бугая рми до. подальВиживаність, при шого викорис38°С хвилин тання Козак 540 + Масив 600 + Сигнал 600 + Лазар 480 + Чижик 420 + Сигнал 660 + Чижик 540 + Ліміт 660 + Масив 540 + Лазар 540 + Сигнал 180 Сигнал 240 Козак 200 «+» - сперма, придатна до використання «-» - сперма не придатна до використання (заявлений метод) Виживаність сперми при 45°С, хвилин Придатність сперми до подальшого використання 100 140 130 100 90 120 100 130 110 120. 20 30 20 + + + + + + + + + + 7 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 60740 8 Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601