Спосіб виготовлення вакцини проти сибірки тварин

Спосіб виготовлення вакцини проти сибірки тварин, що включає виготовлення поживного середовища, виготовлення матриксної культури, контролю матриксної культури, посіву матриксної культури на живильне середовище, визначення 3 - фільтрація надосаду через стерилізуючі фільтри; - визначення концентрації екстрацелюлярного токсину. 5. Виготовлення 30±3 % розчину гліцерину: - виготовлення 30±3 % розчину гліцерину; - стерилізація отриманого розчину. 6. Виготовлення рідкої вакцини: - змішування спорової суспензії з екстрацелюлярним токсином та розчином гліцерину; - перевірка контамінації й числа живих спор в 3 1 см вакцини; - перевірка концентрації водневих іонів (рН); - перевірка відсоткового вмісту гліцерину у вакцині; - фасування рідкої вакцини у флакони; - укупорювання, маркування, контролювання вакцини. Технологія виготовлення вакцини "Антравак" аналогічна прототипу, але відрізняється від неї використанням як поживного середовища гідролізату морепродуктів, відсутністю етапу 4 - виготовлення стимулятора імунітету (екстрацелюлярного токсину) та використанням виготовленого за оригінальним прописом фосфатно-буферного розчину для приготування розчину гліцерину. Приклад 1. Процес виготовлення вакцини "Антравак" включає в себе наступні операції: виготовлення поживного середовища з гідролізату морепродуктів або перевару Хоттінгера, виготовлення матриксної культури з виробничого штаму UA07, контроль матриксної культури, посів матриксної культури на живильне середовище, визначення контамінації й типовості бактеріального росту та ступеня спороутворення, змивання спор і отримання спорової суспензії, визначення контамінації 3 й числа живих спор в 1 см спорової суспензії, змішування спорової суспензії з розчином гліцерину, що виготовлений на фосфатно-буферному розчині з додаванням інгредієнтів за оригінальною рецептурою, фасування рідкої вакцини у флакони, укупорювання, маркування, контролювання вакцини. Для виготовлення поживного середовища гідролізат морепродуктів або перевар Хоттінгера розводять дистильованою водою до вмісту 110±10 мг % загального азоту, готують поживний бульйон 3 і асептично вносять в нього на 10 см середовища 3 1±0,5 см культури UA07 та інкубують за температури 36±1 °C. Після перевірки росту культури на типовість, відсутність контамінації її висівають у 3 скляні бутлі ємністю 3 дм , в яких накатано агар з гідролізату морепродуктів або перевару Хоттінге3 ра, в дозі 20±5 см та інкубують за температури 34±2 °C впродовж 96 годин. Далі проводять вибірковий контроль на ступінь спороутворення. Масова доля спор, які видно в полі зору мікроскопа, повинна бути не менше 80 %. За цієї умови для прискорення процесу спороутворення у марлеві 3 пробки бутлів вводять по 2 см скипидару й знову інкубують за тієї ж температури протягом 24 годин. У випадках незадовільного спороутворення (менше 80 % спор у полі зору) допускається інкубування бутлів з посівами до введення у пробки 63248 4 скипидару додатково протягом доби. При спороутворенні більше 90 % спор у полі зору скипидар не застосовують. Після закінчення інкубування здійснюють контроль типовості росту сибіркової культури, для чого всі бутлі продивляються візуально на чистоту і типовість росту сибіркової культури. Культури повинні мати вигляд сірувато-білих дрібнозернистих колоній з сріблястим відтінком. Бутлі із слизовим ростом сибіркової культури та контаміновані сторонньою мікрофлорою бракують. Культури штаму UA07 з типовим ростом змивають стерильним фосфатно-буферним розчином 3 з рН=6,8-7,8 з розрахунку 110±10 см на один бутль. Спорову суспензію зливають з бутлів за допомогою сифону у градуйовані скляні бутлізмішувачі з розчином гліцерину та бусами на дні, які потім прогрівають на водяній бані за температури 60±10 °C протягом 40 хвилин. Бутлі із споровою суспензією шутелюють одну годину, після чого із кожного бутля відбирають зразки для контролю. Бутлі з бактеріальною масою у період проведення контролю зберігають за температури (2-10) °С. Отриману сибіркову спорову суспензію перевіряють: - на контамінацію і типовість росту; 3 - на вміст життєздатних спор в 1 см . Для визначення кількості живих спор із кожно3 го бутля беруть по 5 см суспензії й готують середню пробу. Після ретельного змішування із середнього зразка роблять вісім послідовних 1 8 десятиразових розведень від 10- до 10- , розве7 8 дення 10- і 10- висівають на чашки Петрі з м'ясопептонним агаром (МПА) по 3 чашки на кожне розведення та у м'ясопептонний бульйон (МПБ) у флакони. Розрахунок числа живих спор здійснюють за формулою: N  N8 N 7 , 1,1 де N7 - середнє арифметичне число колоній, які 7 виросли в чашках при посіві із розведення 10- ; N8 - середнє арифметичне число колоній, які 8 виросли в чашках при посіві із розведення 10- ; 1,1 - постійний коефіцієнт. Після отримання позитивних результатів перевірки на контамінацію й визначення числа живих спор, сибіркову бактеріальну масу переносять у реактор з (30±3 %) розчином гліцерину з рН=6,87,8, що виготовлений на фосфатно-буферному розчині з додаванням інгредієнтів за оригінальною рецептурою із розрахунку отримання концентрації 6 12±4 × 10 живих спор в 1см. Розчин гліцерину готують у такий спосіб: до фосфатно-буферного розчину з рН = 6,8-7,8 додають основний перевар Хоттінгера до 10 % та глюкозу до 1 %, підігрівають до повного розчинення глюкози і додають гліцерин до 30 %. Стерилізують за температури 120±2 °C протягом 1,5 години. Розчин гліцерину, що застосовується для виготовлення рідкої вакцини, може викликати загибель однієї з п'яти білих мишей масою 18-20 г протягом однієї доби при внутрішньо3 черевному введенні в об'ємі 0,5см . 5 Отриману у такий спосіб вакцину асептично фасують у флакони, ретельно перемішуючи її за допомогою мішалки при 30-50 об/хв протягом усього процесу фасування для рівномірного розподілення спор. На флакони з вакциною наносять маркування згідно ДСТУ 4614:2006 "Препарати ветеринарні імунобіологічні. Маркування". Після цього проводять контроль вакцини за наступними показниками: визначення зовнішнього вигляду та сторонніх домішок, визначення масового вмісту гліцерину, визначення концентрації іонів 63248 6 водню (рН), контамінація сторонньою мікрофлорою, типовість росту і однорідність культури, кількість живих спор, масова доля спор, капсулоутворення, нешкідливість, залишкова вірулентність, імуногенність. Приклад 2. Перевіряють показники якості комерційної вакцини живої проти сибірки тварин із штаму K-79Z, виробництва Херсонського державного підприємства - біологічна фабрика та вакцини "Антравак" нашого виготовлення. Отримані результати представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Показник Результати контролю Вакцина жива проти Вакцина "Антравак" серій сибірки із штаму K-79Z серій Норма за ТУУ 1 2 3 Норма за ТУУ 1 2 3 рН 6,8-7,8 7,7 7,7 7,7 6,8-7,8 7,4 7,3 7,5 Сірувато-білі колонії в RСірувато-білі колонії в RТиповість росту + + + + + + формі формі Типові Грам+ палички без 2 % 3 % 2 % Типові Грам+ палички без Однорідність культури + + + інволюційних форм інв. інв. інв. інволюційних форм Масова частка спор 80-95 93 95 90 95±5 95 90 95 (%) Кількість живих спор в 20-25 21 23 23 12±4 12 10 11 3 6 1 см (10 ) Капсулоутворення Безкапсульні палички + + + Безкапсульні палички + + + Нешкідливість (доза Кролі живі,без набряків і неКролі живі,без набряків і невведення 100-125 × + + + + + + крозів в місці введення крозів в місці введення 6 10 спор) Залишкова вірулент- Не повинна викликати наНе повинна викликати на8* 9* 8* ність (доза введення бряку, некрозу шкіри. Допусбряку, некрозу шкіри. Не до- + + + /1** /3** /2** 6 10-12,5 × 10 спор) кається загибель 1-2 тварин пускається загибель тварин Повинно вижити не менше Повинно вижити не менше 80 % щеплених морських 80 % щеплених морських свинок і загинути всі контросвинок і загинути всі контро- 9/ 8/ 10/ Імуногенність 8/10 9/10 9/10 льні, або вижити всі щеплені льні, або вижити всі щеплені 10 10 10 і загинути не менше 80 % і загинути не менше 80 % контрольних контрольних Примітка: * - набряки в місці введення; ** - некрози в місці введення. Як видно із таблиці 1, за більшістю показників якості комерційна вакцина і вакцина, розроблена нами аналогічні. В той же час запропонована вакцина "Антравак", що виробляється зі штаму UA07, має значно нижчу залишкову вірулентність (не викликає набряку, некрозу шкіри і, що вкрай важливо, не допускає загибелі тварин) і в дозі, у двічі меншій, ніж у комерційної вакцини забезпечує імунний захист у 80-100 % випадків. Приклад 3. Дослідними і комерційними серіями вакцини імунізували по 2 групи морських свинок вагою 400450 грам. Вакцини вводили згідно настанов по застосуванню. Через 14 діб тваринам вводили патогенну культуру 2-ї вакцини Ценковського в 6 дозі 1±0,2 × 10 спор підшкірно в ділянці живота в 3 об'ємі 0,5±0,05 см . Вакцина жива проти сибірки із штаму K-79Z 6 повинна містити не менше ніж 20-25 × 10 см життєздатних спор. Таку вакцину вводять морським 3 свинкам в об'ємі 0,5 см . Таким чином для щеплення морським свинкам необхідно ввести по 103× 6 3 12,5 см 10 см життєздатних спор вакцини. Запропонована вакцина повинна містити в 1 3 3 см не більше 12±4 × 10 см життєздатних спор. І 3 доза щеплення в об'ємі 0,5 см складає не більше 6 3 6±2 × 10 см життєздатних спор. Облік результатів проводили через 10 діб після зараження. Результати досліду наведені в таблиці 2. 7 63248 8 Таблиця 2 Визначення імуногенності вакцин Вакцина Серія Доза щеплення 6 3 (х10 см спор) Із штаму K1 10-12,5 79Z Із штаму K2 10-12,5 79Z Із штаму K3 10-12,5 79Z «Антра-вак» 1 5-6 «Антра-вак» 2 5-6 «Антра-вак» 3 5-6 Не вакциновані (контрольні) щеплено (гол.) 10 10 2 8 80 10 10 1 9 90 10 10 1 9 90 10 10 10 10 10 10 10 0 2 1 10 10 8 9 0 100 80 90 0 Дані, представлені в таблиці 2, свідчать, що щеплення морських свинок запропонованою вак6 3 циною в дозі 5-6 × 10 см життєздатних спор викликає у 80-100 % випадків несприйнятливість до зараження патогенною культурою 2-ї вакцини Ценковського. Комерційна вакцина дає захист на рівні 80-90 %. Крім того зменшення дози щеплення запропонованої вакцини в 2 рази значно полегшує перебіг поствакцинального періоду у тварин та полегшує проведення обробок ветеринарним спеціалістам. Джерела інформації: 1. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter 2.1.1.- Anthrax. 2. Ветеринарные препараты. Справочник / Под ред. Д.Ф. Осидзе. - М.: Колос, 1981. - С. 163168. 3. Деклараційний патент на винахід № 58093 Спосіб виготовлення вакцини проти сибірки / С.А. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Кількість тварин із кількості заражених заражено % захис(гол.) (гол.) ту захворіло не захворіло Ничик, С.П. Мірошник, Л.М. Іванова та ін.// №58093. - заявл.30.09.2002, опубл. 15.07.2003. Бюл. № 7.-4 с. 4. Патент України на корисну модель № 46896 Спосіб виготовлення вакцини живої спорової проти сибірки тварин концентрованої / В.М. Дзюба, В.В. Доценко, С.П. Мірошник та ін. // № 46896.заявл. 13.07.2010, опубл. 11.01.2010. - Бюл. № 1.-6 с. 5. Патент на изобретение RU № 2220742С2 Комбинированная вакцина против сибирской язвы животных / Е.В. Пименов, Е.С. Воронин, В.М. Котляров и др.// RU № 2220742С2, заявл. 26.12.2001, опубл. 10.01 2004. 6. Патент на изобретение RU № 2095409С1 Способ изготовления вакцины против сибирской язвы животных / В.А. Гаврилов, Ю.В. Числов, Л.Ф. Николайчук // RU № 2095409С1. - заявл. 27.06.1995, опубл. 10.11.1997. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601