Спосіб виготовлення вакцини живої спорової проти сибірки тварин концентрованої

1. Спосіб виготовлення вакцини живої спорової проти сибірки тварин концентрованої, що включає підготовку посівного матеріалу штаму, його культивування у рідкому живильному середовищі, яке містить джерело азоту, дріжджовий екстракт, з регуляцією в ньому рН і аерацією, який відрізняється тим, що як джерело азоту використовують пептон ферментативний і живильне середовище додатково містить: калій фосфорнокислий двозаміщений, кальцій хлористий, магній сірчанокислий, цинк сірчанокислий, мідь сірчанокислу, залізо сірчанокисле, амоній сірчанокислий, антиспінювач, при такому співвідношенні компонентів, мас. ч.: дріжджовий екстракт з вмістом сухої речовини 0,2-0,24 % 0,25 2 (19) 1 3 ного середовища використовують щільне живильне середовище, що містить, як основний компонент - гідролізат кормових дріжджів. Для виготовлення спорової форми культивування проводять в продовж 16-18 годин при температурі +34-35 °С, а потім 56-64 год. при +28-30 °С (А. с. СРСР № 1837071 C12N3/00, А61К39/00, опубл. 30.08.93 Бюл. № 32). Недоліком цього способу є тривалість процесу - 72-82 год., його трудомісткість та недостатній вихід кількості спор. Найбільш близьким технічним рішенням, яке обране в якості прототипу, є спосіб виготовлення вакцини проти сибірки тварин із вакцинного штаму Bacillus anthracis СТИ-1 у рідкому живильному середовищі. Виготовлення вакцини включає одностадійне культивування штаму СТИ-1 у рідкому живильному середовищі, що містить, в якості джерела азоту 77-82 % панкреатичного гідролізату казеїну і 18-23 % дріжджового екстракту, з регуляцією рН і аерацією. Культивування проводять у перебігу 41-48 годин при температурі +30-33 °С і рН середовища 8-9 (патент Росії № 1566532, C12N3/00, А61К39/00 опубл. 20.12.1995) Недоліком цього способу залишається недостатній вихід кількості спор, тривалість виготовлення вакцини та висока вартість компонентів, що входять до складу живильного середовища. В основу корисної моделі поставлено завдання: у способі виготовлення вакцини проти сибірки тварин збільшити вихід кількості спор з одиниці живильного середовища, зменшити матеріальні витрати на виготовлення вакцини, скоротити її тривалість та підвищити імуногенну активність препарату при спрощенні процесу виготовлення. Поставлене завдання вирішується тим, що у відомому способі виготовлення вакцини живої спорової проти сибірки тварин концентрованої, що включає підготовку посівного матеріалу штаму, його культивування у рідкому живильному середовищі, яке містить джерело азоту, дріжджовий екстракт, з регуляцією в ньому рН і аерацією, згідно з корисною моделлю, в якості джерела азоту використовують пептон ферментативний і живильне середовище додатково містить: калій фосфорнокислий двозаміщений, кальцій хлористий, магній сірчанокислий, цинк сірчанокислий, мідь сірчанокислу, залізо сірчанокисле, амоній сірчанокислий, антивспінювач, при такому співвідношенні компонентів, мас. ч.: дріжджовий екстракт з вмістом сухої речовини 0,2-0,24 % 0,23-0,25 пептон ферментативний 0,19-0,22 калій фосфорнокислий двозаміщений К2НРО4 0,045-0,055 кальцій хлористий СаСl2 0,0045-0,0055 магній сірчанокислий MgSO4 0,035-0,045 цинк сірчанокислий ZnSO4 0,001-0,0012 мідь сірчанокислу CuSO4 0,001-0,0012 залізо сірчанокисле FeSO4 0,0001-0,00012 амоній сірчанокислий NH4(SO4)2 0,19-0,21 антивспінювач 0,01-0,02 46896 4 вода демінералізована (рН 7,4-7,6) решта Крім того, підготовку посівного матеріалу штаму, його культивування у рідкому живильному середовищі проводять продовж 16-24 годин, спочатку при температурі +36±1 °С протягом 12-18 годин підтримуючи рівень концентрації розчиненого кисню в середовищі 5,5±0,5 молей на 1 л середовища за годину, а потім 4-6 годин без аерації при температурі +35-36 °С. Також, в якості посівного матеріалу для виготовлення вакцини використовують штам Bacillus anthracis СБ. У запропонованому способі виготовлення живої спорової вакцини проти сибірки тварин із штаму Bacillus anthracis СБ концентрованої використовується сибірковий вакцинний штам, що являє собою селекційний варіант вакцинного штаму Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ. Він характеризується високою імуногеністю, не утворює капсул, має вище продуктивність серед відомих штамів Bacillus anthracis. Синтез токсину кодується плазмою рХо -1, яка несе три гени екзотоксину - pag, lef, cya. Перший з них кодує синтез протективного антигену (рА), другий -летального фактора, третій набрякового фактора, із них протективний антиген - основний компонент сибіркових вакцин. Плазміда рХо - 2 несе гени, які визначають синтез капсули відповідальної за вірулентність штамів, яка в штамі Bacillus anthracis СБ -відсутня. Використання в якості посівного матеріалу вакцинний штам Bacillus anthracis СБ, який має широкий імуногенний спектр до різних патогенних штамів, дає змогу отримати стійку і тривалу імунну відповідь у тварин. Спосіб здійснюють таким чином. Вирощування мікроорганізму проводять у рідкому живильному середовищі, в якому дріжджовий екстракт з вмістом сухої речовини 0,2-0,24 % становить 25 %, а пептон ферментативний - 0,19%0,22 %. Процес проходить в ферментері з аерацією. При цьому рН середовища підтримують на рівні 7,0-7,2 при температурі + 36±1 °С, аерують середовище протягом 16-18 годин, підтримуючи концентрацію розчиненого кисню в середовищі 5,5±0,5 молей на 1 л середовища за годину, а потім витримують 4-6 годин без аерації при температурі +35-36 °С. Кількість одержаних спор збільшується при постійній подачі в живильне середовище повітря для підтримки оптимальної концентрації розчиненого кисню, а також за рахунок мікроелементів, що входять до складу живильного середовища і використовуються мікроорганізмами в процесі асиміляції. Якість вакцини підвищується за рахунок зменшення концентрації продуктів метаболізму, і збільшення протективного антигену і кількості зрілих спор. Використання рідкого живильного середовища на дріжджово-пептоновій основі, при даному режимі виготовлення вакцини дає змогу збільшити майже в два рази вихід спор з одиниці живильного середовища та зменшити тривалість виготовлення в порівнянні з прототипом. 5 46896 6 Таблиця Результати культивування штаму СТИ-1 і штаму СБ Режим культивування Рівень спороутворення, % 16 год. 24 год. 41 год. 48 год. 1 2 3 4 5 6 КазеїноpH 8,0, при t - +30-33 °C витрати повітря 2.5дріжджове рідке 3,0 дм3/хв., час аерації - 36 год., без аерації 0 0 85-90 90-92 середовище 5-12 год. При t- +20 °C (прототип) ДріжджовоПри t - +36±1 °C рН 7,4-7,6, час аерації 14-18 пептонове рідке год., без аерації - 4-6 год. При t - +35-36 °C 70-85 90-95 середовище витрати повітря 5,5 мілімолей О2/год. – 25 3 (ДПС) дм /хв. Середовище Приклад. Культуру штаму Bacillus anthracis СБ у кількості 2-3 млрд. життєздатних спор вносять у ферментер в рідке живильне середовище - 100 л, яке містить дріжджовий екстракт з вмістом сухої речовини 0,2-0,24 % - 25 л, пептон ферментативний - 0,2 % - 200 г, калій фосфорнокислий двозаміщений К2НРО4 - 50 г, кальцій хлористий СаСl2 - 5 г, магній сірчанокислий MgSO4 - 40 г, цинк сірчанокислий ZnSO4 – 1 г, мідь сірчанокислу CuSO4 - 1 г, залізо сірчанокисле FeSO4 - 0,1 г, амоній сірчанокислий NH4(SO4)2 - 200 г, антивспінювач - 150 см3, вода демінералізована (рН 7,4-7,6) решта. При цьому вміст в середовищі загального і амінного азоту складає відповідно 90-100 та 40-50 мг %. Встановлюють температуру +37 °С, подають у середовище повітря, встановлюють рівень аерації 5,5 молей О2 на літр, підтримують рН середовища на рівні 7,0. Повітря подають протягом 16-18 го Комп’ютерна верстка І.Скворцова дин. Потім витримують засіяне живильне середовище 5-10 год. без аерації. Після цього проводять контроль накопичених спор. Вміст спор складає 110-140 млн. в одному см3, що становить 95 %. Отриману сировину розводять буферногліцериновим розчином до 30±3 % вмісту гліцерину. Одержана вакцина є зависсю живих спор сибіркової безкапсульної авірулентної культури штаму Bacillus anthracis СБ у стабілізуючому середовищі тридцяти відсотковому гліцерині. В одній комерційній дозі (1 см3) - 25 млн. живих спор. Використання запропонованого способу виготовлення живої спорової вакцини проти сибірки тварин із штаму Bacillus anthracis СБ концентрованої в порівнянні з відомими дозволяє виготовляти вакцину проти сибірки тварин з більшою кількістю спор з одиниці живильного середовища, підвищити якість вакцини, скоротити термін її виготовлення та знизити витрати на виробництво вакцини. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601