Спосіб моделювання цукрового предіабету

Винахід належить до галузі медицини, зокрема до експериментальної ендокринології і може бути використаний для моделювання ранньої стадії цукрового діабету у тварин. Відомий спосіб моделювання цукрового предіабету, при якому експериментальним щурам одноразово внутрішньовенно вводять алоксан у розчині NaCl у дозі 37мг/кг маси тварини [1]. Для запобігання утворенню під дією алоксану діабетогенного фактору й обмеження гіперглікемії тварині перетискають судини, що постачають кров'ю гастроспленальну частину підшлункової залози. При цьому досягається зниження рівня глюкози з 17,4ммоль/л до 5,82 ммоль/л. Основними недоліками аналога є невисока точність відтворення моделі цукрового предіабету, складність і неекономічність. Досягнутий рівень глюкози все-таки перевищує показник у контрольних тварин, рівний 4,0-4,5ммоль/л, що не відповідає картині прихованих порушень вуглеводного обміну, яка характеризується нормальним вмістом базального рівня глюкози. Проведення хірургічного втр учання викликає значну втрату тварин, що вимагає коштів на їхнє поповнення. Відомий також спосіб моделювання цукрового предіабету, при якому експериментальним щурам лінії Вістар одноразово внутрішньочеревинно вводять алоксан у дозі 18мг на 100г маси тварини [2]. Використаний прийом введення алоксану і дозування приводять до одержання моделі цукрового діабету. Для зниження рівня гіперглікемії тварині на протязі 2-3 днів вводять інсулін у дозі 2 ОД. Навіть при цьому прийомі обмеження гіперглікемії рівень цукру в крові експериментальних тварин у 2,2 рази вище, ніж у тварин контрольної групи, яким алоксан не вводили. Тварин використовують у подальших експериментальних дослідженнях тільки через два тижні після введення алоксану. Як випливає з вищенаведеного, основними недоліками аналога є низька точність відтворення моделі цукрового предіабету, її невідповідність картині порушення вуглеводного обміну в людини, а також тривалість експериментальних робіт, значні матеріальні витрати. Відомий спосіб моделювання цукрового предіабету, при якому експериментальним щурам лінії Вістар масою 200-280г одноразово внутрішньочеревинно вводять алоксан у дозі 17мг на 100г маси в 0,02М ацетатному буфері [3]. Проведений тест толерантності до глюкози /ТТГ/ показав, що тільки в 30% тварин із загального числа розвиваються приховані прояви діабету. При цьому в таких тварин рівень глюкози на 3-ій день після введення алоксану складав 21,7±1,8ммоль/л, що значно перевищувало нормальний рівень, а крива зміни вмісту глюкози в ТТГ мала такий же виразний гіперглікемічний характер, як і у тварин з цукровим діабетом. Істотним недоліком даного способу є невисока точність моделювання в зв'язку з високим базальним рівнем глюкози після введення алоксану. Крім того, спосіб багатовитратний, що викликано великими втратами експериментальних тварин і необхідністю їхнього поповнення. Відомий також спосіб моделювання цукрового предіабету в експериментальних кроликів породи Шиншилла, яким щодня протягом 3-9 місяців проводять пероральне введення глибенкламіду в дозі 1мг/кг [4]. Відповідно до винаходу створюється модель доклінічної стадії інсулінзалежного діабету. Введення препарату глибенкламіда супроводжується деструкцією інсулинсекретуючи х клітин підшлункової залози /b-клітини/. Однак при цьому не відтворюються відхилення в глікемічній кривій, тобто не відтворюється одна з основних ознак цукрового предіабету. У зв'язку з чим даний спосіб не може бути використаний для створення моделі цукрового предіабету. Відомий спосіб моделювання цукрового предіабету шля хом введення експериментальним щурам лінії Вістар алоксану в дозі 15мг на 100г маси тварини [5]. Для подальших доклінічних досліджень відбирали тільки тих щурів, у яких рівень цукру в крові не перевищував 7,2ммоль/л. При цьому досліджували відхилення при проведенні ТТГ. Відповідно до винаходу, ця модель віднесена до варіанта «полегшеного» типу експериментального діабету, що відповідає порушенню вуглеводного обміну в людини. Істотним недоліком даного способу є невисока точність моделювання, тому що в ци х умовах експерименту зберігається високий базальний рівень глюкози після введення алоксану і не відтворюються порушення, найбільш характерні для перебігу предіабету в людини. Крім того, спосіб багатовитратний, що обумовлено великими втратами експериментальних тварин і необхідністю їхнього поповнення. Найбільш близьким аналогом є спосіб моделювання цукрового предіабету шляхом одноразового введенняекспериментальній тварині алокеану [6]. Кожній експериментальній тварині з дослідної групи-щур у алоксан вводили внутрішньочеревинно в дозі 130мг на кг маси. Через два дні після введення алоксану в ТТГ виявлені порушення вуглеводного обміну. Однак базальний рівень глюкози у тварин дослідної групи складав 5,83ммоль/л, у той час як у щурів контрольної групи він був рівним 4,18ммоль/л. Тому основним недоліком цього аналога також є низька точність відтворення моделі цукрового предіабету, короткочасність його прояву. Отримана модель не відтворює точн у картину прихованих порушень вуглеводного обміну в людини, у зв'язку з чим непридатна для вивчення лікувальних засобів, здатних запобігти розвитку цукрового діабету в людини та його лікування. Крім того, дана модель не гарантує одержання достовірних результатів при проведенні доклінічних досліджень і економічно невигідна. Це обумовлено необхідністю придбання і утримання великої кількості тварин, медичних препаратів, а також витрат на оплату праці в зв'язку з тривалістю проведення експерименту. В основу винаходу поставлена задача удосконалення способу моделювання цукрового предіабету, який, завдяки новому дозуванню препарату і прийому його введення, дозволить підвищити точність відтворення прихованих порушень вуглеводного обміну з наближенням до перебігу патології в людини, економічність і збільшити тривалість існування моделі. Поставлена задача вирішується тим, що в способі моделювання цукрового предіабету шля хом одноразового введення експериментальній тварині алоксану, його вводять у дозі 7,5мг на 100г маси тварини. Сутність винаходу полягає в наступному. Як відомо з методичних рекомендацій «Оценка результатов глюкозотолерантного теста по обобщенному критерию», Министерство здравоохранения УССР, Киев, 1984г., С. 12 у людини, схильної до цукрового діабету, після навантаження глюкозою відбувається ріст глюкози в крові, рівень якої через 3 години не повертається до базального. Сукупність істотних ознак запропонованого винаходу дозволяє створити аналогічний стан цукрового предіабету в експериментальної тварини і забезпечити стабільність такого стану протягом 2-х тижнів. Відтворена тривала в часі точна модель цукрового предіабету дозволяє підвищити вірогідність результатів доклінічних іспитів лікувальних препаратів, використовуваних для профілактики цукрового діабету в людини без додаткових ви трат на поповнення експериментальних тварин, придбання препаратів, інвентарю і т.п. засобів. Проведені іспити показали, що встановлена доза алоксану - 7,5мг на 100г маси тварини разом з підшкірним введенням в організм є оптимальною для досягнення нового технічного результату. Спосіб моделювання цукрового предіабету здійснюють таким чином. Готують 5,0% водний розчин алоксану, для чого 5г алоксану розчиняють у 100мл дистильованої води. Встановлена доза алоксану - 7,5мг міститься в 0,15мл водного розчину препарату. Загальний обсяг свіжеприготованого розчину алоксану, що вводиться, визначають в залежності від маси тварини з розрахунку 0,15мл на 100г його маси. Беруть щура масою 200-250г і одноразово підшкірно вводять відповідну кількість 5% водного розчину алоксану. Так, щур у масою 200г вводять 0,3мл водного розчину алоксану, а масою 250г вводять 0,375мл водного розчину алоксану. Днем початку створення моделі цукрового предіабету вважають перший день введення алоксану. Стан предіабету у щура триває протягом 14 днів. Винахід ілюструється наступними прикладами. Приклад 1 Дослідний щур - самець лінії Вістар утримувався в умовах віварію інституту на стандартному харчовому і питному раціоні. Щуру введений одноразово підшкірно діабетогенний препарат алоксан у виді свіжеприготованого 5% водного розчину в кількості 0,36мл, що відповідало дозі 7,5мг в перерахуванні на 100,0г маси тварини. Через 7 днів після введення алоксану обмірювана маса тварини, кількість випитої за добу води і добовий діурез. У цього ж щура в той же день ранком після попереднього 10-ти годинного голодування узята кров із хвостової вени і визначений базальний рівень глюкози в крові уніфікованим глюкозооксидазним методом [Приказ МЗ СССР №960 от 15.10.1974 «Об унифицикации клинических лабораторных методов исследования» М., 1974. п.3.2.1. - С.65-69]. Для доказу відповідності відтвореної моделі цукрового предіабету прихованим порушенням вуглеводного обміну в людини проведений тест толерантності до глюкози - ТТГ загальноприйнятим методом [А.Т. Горячковский. Клиническая биохимия. Одесса. Астропринт, 1998. - С.301-305]. Для цього щуру введений одноразово внутрішньочеревинно 40% розчин глюкози в кількості 2,4мл, що відповідало дозі 4,0г глюкози в перерахуванні на кг маси тварини. Через 1, 2 і 3 години після навантаження глюкозою узята кров із хвостової веки і визначений вміст глюкози в крові. У той же день у контрольного щура - самця лінії Вістар, що знаходився в аналогічних умовах віварію, обмірювані маса, кількість випитої за добу води і добовий діурез. Для проведення ТТГ контрольному щур у ввели одноразово внутрішньочеревинно 2,4мл 40% розчину глюкози, що відповідало дозі 4,0г глюкози в перерахуванні на кг маси тварини. Результати аналізів дослідного і контрольного щурів через 7 днів після введення дослідному щуру алоксану наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Експериментальна тварина Дослідний щур Контрольний щур Маса тварини (г) 243,0 204,0 Кількість випитої за добу води (мл) 13,1 13,5 ТТГ (рівень глюкози, ммоль/л) Добовий діурез (мл/см 2) Базальний Через 1 год Через 2 год Через 3 год 1,20 1,28 4,34 4,40 7,94 6,20 6,07 4,60 5,63 4,40 Приклад 2 Дослідний щур - самець лінії Вістар утримувався в умовах віварію інституту на стандартному харчовому і питному раціоні. Щуру одноразово підшкірно був введений свіжеприготований 5% водний розчин алоксану в кількості 0,37мл, що відповідало дозі 7,5мг при перерахуванні на 100г маси тварини. Вимір маси тварини, кількості випитої за добу води, добового діурезу і тест толерантності до глюкози проведені через 14 днів після введення дози алоксану аналогічно прикладу 1. Одночасно проведені дослідження в контрольного щура-самця лінії Вістар за прикладом 1. Результати аналізів дослідного і контрольного щурів через 14 днів після введення дослідному щуру алоксану наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Експериментальна тварина Дослідний щур Контрольний щур Маса тварини (г) 247,0 210,0 Кількість випитої за добу води (мл) 12,6 13,8 ТТГ (рівень глюкози, ммоль/л) Добовий діурез (мл/см 2) Базальний Через 1 год Через 2 год Через 3 год 1,19 1,24 4,48 4,50 11,20 6,20 6,42 4,70 5,30 4,20 Приклад 3 Дослідний щур - самець лінії Вістар утримувався в умовах віварію інституту на стандартному харчовому і питному раціоні. Щуру одноразово підшкірно був введений свіжеприготований 5% водний розчин алоксану в кількості 0,34мл, що відповідало дозі 7,5мг при перерахуванні на 100,0г маси тварини. Для контролю був використаний щур - самець лінії Вістар, що знаходився в аналогічних умовах віварію. У дослідного і контрольного щурів через 21 день були проведені всі дослідження як у прикладі 1. Результати аналізів дослідного і контрольного щурів через 21 день після введення дослідному щуру алоксану наведені в таблиці 3. Таблиця 3 Експериментальна тварина Кількість Маса випитої за тварини (г) добу води (мл) Дослідний щур Контрольний щур 227,0 208,0 12,0 13,5 ТТГ (рівень глюкози, ммоль/л) Добовий діурез (мл/см 2) Базальний Через 1 год 1,22 1,20 4,15 4,20 5,77 6,10 Через 2 Через год 3 год 4,65 4,60 4,15 4,20 Приклад 4 З 45 білих щурів лінії Вістар, що утримувались в умовах віварію інституту на стандартному питному і харчовому раціоні, були сформовані 3 дослідні групи: перша - у кількості 15 тварин; друга - у кількості 8 тварин; третя - у кількості 10 тварин. Сформовано контрольну гр упу з 12 тварин. Маса тварин у середньому складала 200-250г. Усім тваринам дослідних гр уп в один день був введений алоксан у вигляді 5% водного розчину в дозі 7,5мг на 100г маси кожної тварини. Дослідження ТТГ, вимірювання маси тіла, кількості випитої за добу води, добового діурезу проведені як у прикладі 1: через 7 днів у тварин 1-ої дослідної групи; через 14 днів у тварин 2-ої дослідної групи; через 21 день у тварин 3-їй дослідної групи. Результати ТТГ у тварин дослідних і контрольної груп наведені в таблиці 4. Таблиця 4 Група експериментальних тварин Контрольна група 1-а дослідна група 2-а дослідна група 3-я дослідна група Базальний 4,21±0,13 4,08±0,11 р>0,5 4,50±0,19 р>0,5 4,26±0,09 р>0,5 ТТГ (рівень глюкози, ммоль/л) Через 1 час Через 2 часа М±m М±m 6,44±0,26 4,80±0,20 7,58±0,31 5,85±0,20 р0,5 р>0,5 3-я дослідна група М±m 238,0±6,04 р0,5 1,70±0,22 р>0,05 с - розраховано по відношенню до даних контрольної групи Результати всіх досліджень приведені в таблицях 4 і 5 оброблялися методами варіаційної статистики. Відомо, наприклад із опису винаходу до а. с. СССР №1561078, МПК5 G09В 23/28, 30.04.90, виданому на «Способ моделирования сахарного диабета», у тварин-щурів із клінічною картиною цукрового діабету спостерігається різка спрага - вони випивають за добу по 60мл води, схудіння до виснаження. Разом з тим, як бачимо з наведених у таблицях 1, 2, 3 і 5 даних у дослідних щурів протягом усього періоду спостережень не відбувається зниження маси тіла, не збільшується кількість води, що споживається за добу, і діурез. Зазначене підтверджує вірогідність створення моделі цукрового предіабету. Це також було підтверджено біохімічними, морфологічними й імунологічними дослідженнями. Вони виявили незначні відхилення з боку показників, що досліджувалися, характерні для патогенезу цукрового діабету (наприклад, активація перекісного окислювання ліпідів, зниження активності супероксіддисмутази метаболічної функції фагоцитів) тільки лише в початковий період моделювання з наступною нормалізацією до 14-го дня від початку створення моделі цукрового предіабету. Таким чином, приведені результати досліджень підтверджують, що заявлений винахід дозволяє найбільш точно відтворити порушення вуглеводного обміну, відповідні до тих, що спостерігаються у хворих з факторами ризику розвитку цукрового діабету. Тривалість збереження цього стану до 14 днів робить цю модель оптимальною для вивчення механізму дії різних лікувальних засобів, використовуваних для профілактики і лікування цукрового діабету. Винахід дозволяє використовувати гр упу тварин досить тривалий час. При цьому відпадає необхідність у їхньому поповненні, придбанні додаткових засобів, що підвищує економічність способу. Джерела інформації: і. Кудряшов Б.А., Тарасов Ю.А., Ульянов A.M. Поджелудочная железа как источник естественного диабетогенного фактора при аллоксановом диабете // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1991. - №2. - С. 46-47. 2. Никотинамидные коферменты в регуляции клеточного метаболизма при разных типах диабета / Великий Н.Н., Обросова И.Г., Ефимов А.С. и др. // Вопросы медицинской химии. - 1992. - Т.38, №4. - С.45-52. 3. Пальчикова Н.А., Селятицкая В.Г., Шорин Ю.П. Количественная оценка чувствительности экспериментальных животных к диабетогенному действию аллоксана // Проблемы эндокринологии. - 1987. Т.33, №4. - С. 65-68. 4. А.С. СССР №1439658, МПК4 G09В 23/28, 23.11.1988. «Способ моделирования сахарного диабета». 5. Полушина Н.Д., Бо твинева Л.А., Фролков В.К. Изменение чувстви тельности тканей к инсулину под действием питьевых минеральных вод (клинико-экспериментальные исследования) // Вопросы курортологии, физиотерапии и ЛФК. - 1999. - №6. - С. 16 -19. 6. Молоковский Д.С., Давыдов В.В., Тюленев В.В. Действие адаптогенных фитопрепаратов при экспериментальном аллоксановом диабете // Проблемы эндокринологии. - 1989. - Т. 35, №6. - С.82-86.