Спосіб оцінки ефективності поліхіміотерапії у хворих на рак сечового міхура

Спосіб оцінки ефективності поліхіміотерапії у хворих на рак сечового міхура, що передбачає патологогістологічне дослідження операційного матеріалу пухлини, який відрізняється тим, що для визначення кількості апоптозно змінених клітин використовують TUNEL-метод. (19) (21) u201103494 (22) 24.03.2011 (24) 10.10.2011 (46) 10.10.2011, Бюл.№ 19, 2011 р. (72) СТАХОВСКИЙ ЕДУАРД ОЛЕКСАНДРОВИЧ, БЛЮМ ЯРОСЛАВ БОРИСОВИЧ, ЯЦИНА ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, ВІТРУК ЮРИЙ ВАСИЛЬОВИЧ, ВОЙЛЕНКО ОЛЕГ АНАТОЛІЙОВИЧ, ЄМЕЦЬ АЛЛА ІВАНІВНА, ШЕРЕМЕТ ЯРИНА ОЛЕКСАНДРІВНА, ВЕРНИГОРОДСЬКИЙ СЕРГІЙ ВІКТОРОВИЧ 3 великої кількості зразків, відносна простота здійснення методу, висока чутливість. В основі методу лежить включення флуоресцентно міченого дезоксинуклеотиду в пошкоджену ДНК. В порівнянні з вище перерахованим методами TUNEL дозволяє паралельне проведення імуногістохімічних та окремих гістохімічних реакцій на одному й тому самому зрізі. У хворого біопсійний матеріал отримують під час оперативного втручання або цистоскопічного дослідження за допомогою резектоскопу (Richard Wolf, Німеччина). Шматочки слизової оболонки сечового міхура (з muscularis mucosae включно) вилучають з ураджених пухлиною відділів. Фіксують в 10 % розчині нейтрального формаліну (рН 7,4) протягом 24 годин. Після дегідратації їх заливають у високо очищений парафін з полімерними добавками (Richard-Allan Scientific) при температурі не вище 60 °C та під візуальним контролем біоптата у блоці. Зріз має проходити перпендикулярно до поверхні слизової оболонки. На ротаційному мікротомі Microm HM325 з системою переносу зрізів STS (Carl Zeiss, Німеччина) виготовляють серійні гістологічні зрізи товщиною (5±1 мкм), які монтують на предметне скло зі спеціальним адгезивним покриттям. Для визначення нуклеосомної фрагментації ДНК in situ проводять TUNEL-аналіз, використовуючи набір In Situ Cell Death Detection Kit,TMR red # 12156792910 (Pierce, Німеччина) за такою послідовністю: Triton X-100 в 0,1 цитраті натрію протягом 5 хв. на льодовій бані; - депарафінізація підготовлених зрізів пухлин ксилолом протягом 5 хвилин при кімнатній температурі; - до зразків додають чистий розчин ксилолу та інкубують їх протягом 7 хвилин при кімнатній температурі на шейкері; - дегідратацію зразків виконують шляхом інкубації зразків у серії етилових спиртів: абсолютному спирті, 90 %-му, 80 %-му, 70 %-му розчині етилового спирту та 50 %-му етанолі; - зразки промиваються тричі в розчині фосфатного буферу PBS; - пермеабілiзацію плазматичної мембрани проводять в 0,1 %-му розчині 6, до зразків додають реакційну суміш, що містить флуоресцентно мічений дезоксинуклеотид і термінальну дезоксинуклеотидил трансферазу та інкубують при 37 °C впродовж 1 години в темряві. Ядра клітин візуалізують за допомогою 4,6діаміно-2-феніліндолу (DAPI) (Sigma, США) в концентрації 10 мг/л. TUNEL-реакцію детектували, використовуючи конфокальний лазерний скануючий мікроскоп LSM 510 МЕТА (Carl Zeiss). Приготовлені зразки досліджували з наступною мультиканальною конфігурацією: - канал для DAPI: збудження діодним лазером ультрафіолетового діапазону (UV) з довжиною хвилі 405 нм (інтенсивність роботи лазера 1015 %), розділяючий фільтр HFT405/488, дзеркало, фільтр емісії ВР 420-480 нм; - канал для візуалізації тетраетил-родаміну (детекція апоптотичних клітин): збудження лазе 63533 4 ром видимого діапазону світла (VIS) гелій-неонним лазером з довжиною хвилі 543 нм (інтенсивність роботи лазера 65 %), розділяючий фільтр HFT488/543, дзеркало, фільтр емісії LP 560; - використовували об'єктив Plan-Apochromat 63*/1,4 Oil DIC. На основі серійних оптичних зрізів, зроблених з інтервалом 0,3-0,5 мкм, будували тривимірні моделі за допомогою програмного забезпечення version 4.0 SP2 (Carl Zeiss, Німеччина). Показник апоптичного індексу виражався у відсотковому співвідношенні клітин, що перебували в стані апоптозу із розрахунку на 200 досліджених пухлинних клітин.: до 10 % TUNEL позитивних неефективна поліхіміотерапія, при наявності 10 %30 % - низька ефективність, 30-60 % помірна ефективність та > 60 % - висока ефективність поліхіміотерапії за стандартною схемою лікування інвазивного раку сечового міхура згідно Guidelines European Assotiation of Urology, 2010. Таким чином, на основі застосування наведеного способу можна чітко визначитися з ефективністю проведеної ПХТ у хворих на рак сечового міхура. Прикладом конкретного виконання способу є витяги з історії хвороб двох хворих. І. Хворий Г., 63 роки. Історія хвороби № 6673. Звернувся за допомогою 06.06.2010 р. зі скаргами на гематурію протягом останніх 3-х місяців. При до обстеженні по результатам комп'ютерної томографії (КТ) було виявлене утворення сечового міхура. 08.02.2010 р. виконано цистоскопія, ТУР біопсія утворення. Патогістологічний висновок № 3474/10 від 11.02.2010: помірно диференційований перехідноклітинний рак сечового міхура з інвазією м'язового шару. Встановлено діагноз: Са vesica urinae T2aNxM0G2 стадія II клінічна група 2. За тиждень вирішено розпочати проведення курсу поліхімеотерапії (ПХТ) за схемою ГемцетабінЦисплатин. Після проведення 3-х курсів ПХТ виконана повторна цистоскопія та ТУР-біопсія утворення. Для визначення нуклеосомної фрагментації ДНК in situ провели TUNEL-аналіз, використовуючи набір In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red # 12156792910 (Pierce, Німеччина) за такою послідовністю: Triton Х-100 в 0,1 цитраті натрію протягом 5 хв. на льодовій бані; - депарафінізували підготовлені зрізи пухлин ксилолом протягом 5 хвилин при кімнатній температурі; - до зразків додали чистий розчин ксилолу та інкубували їх протягом 7 хвилин при кімнатній температурі на шейкері; - дегідратацію зразків виконували шляхом інкубації зразків у серії етилових спиртів: абсолютному спирті, 90 %-му, 80 %-му, 70 %-му розчині етилового спирту та 50 %-му етанолі; - зразки промили тричі в розчині фосфатного буферу PBS; - пермеабілiзацію плазматичної мембрани провели в 0,1 %-му розчині 6, до зразків додали реакційну суміш, що містить флуоресцентно мічений дезоксинуклеотид і термінальну дезоксинук 5 леотидил трансферазу та інкубували при 37 °C впродовж 1 години в темряві. Ядра клітин візуалізували за допомогою 4,6діамiно-2-феніліндолу (DAPI) (Sigma, США) в концентрації 10 мг/л. TUNEL-реакцію детектували, використовуючи конфокальний лазерний скануючий мікроскоп LSM510 МЕТА (Carl Zeiss). Приготовлені зразки досліджували з наступною мультиканальною конфігурацією: - канал для DAPI: збудження діодним лазером ультрафіолетового діапазону (UV) з довжиною хвилі 405 нм (інтенсивність роботи лазера 1015 %), розділяючий фільтр HFT405/488, дзеркало, фільтр емісії ВР 420-480 нм; - канал для візуалізації тетраетил-родаміну (детекція апоптотичних клітин): збудження лазером видимого діапазону світла (VIS) гелій-неонним лазером з довжиною хвилі 543 нм (інтенсивність роботи лазера 65 %), розділяючий фільтр HFT488/543, дзеркало, фільтр емісії LP560; - використовували об'єктив Plan-Apochromat 63*/1,4 Oil DIC. На основі серійних оптичних зрізів, зроблених з інтервалом 0,3-0,5 мкм, будували тривимірні моделі за допомогою програмного забезпечення version 4.0 SP2 (Carl Zeiss, Німеччина). Виявлено, що 55 % ракових клітин дали позитивну реакцію (фіг.1). Таким чином, кількість апоптично змінених ракових клітин сечового міхура (55 %) знаходиться в межах 30-60 %, що свідчить про помірну ефективність заснованої поліхіміотерапії. II. Хворий Ф., 59 років. Історія хвороби № 1023. Звернувся за допомогою 02.02.2009 р. зі скаргами на гематурію протягом останніх 5-ти місяців. При дообстеженні за результатами КТ виявлене утворення сечового міхура. 25.08.2009 р. виконано цистоскопія, ТУР-біопсія утворення. Патогiстологічний висновок №63-82/06: високо диференційований перехідноклітинний рак сечового міхура з глибокою інвазією м'язового шару. Встановлено діагноз: Са vesica urinae T2bNxM0G1 стадія II клінічна група 2. Вирішено розпочати проведення курсу поліхімеотерапії (ПХТ) за схемою Гемцетабін-Цисплатин, після проведення 3-х курсів ПХТ виконана повторна цистоскопія, ТУРбіопсія утворення. Матеріал слизової оболонки сечового міхура відправлено для дослідження за методом TUNEL. Для визначення нуклеосомної фрагментації ДНК in situ провели TUNEL-аналіз, використовуючи набір In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red# 12156792910 (Pierce, Німеччина) за такою послідовністю: Triton X-100 в 0,1 цитраті натрію протягом 5 хв. на льодовій бані; - депарафінізували підготовлені зрізи пухлин ксилолом протягом 5 хвилин при кімнатній температурі; - до зразків додали чистий розчин ксилолу та інкубували їх протягом 7 хвилин при кімнатній температурі на шейкері; - дегідратацію зразків виконували шляхом інкубації зразків у серії етилових спиртів: абсолютному спирті, 90 %-му, 80 %-му, 70 %-му розчині етилового спирту та 50 %-му етанолі; 63533 6 - зразки промили тричі в розчині фосфатного буферу PBS; - пермеабілізацію плазматичної мембрани провели в 0,1 %-му розчині 6, до зразків додали реакційну суміш, що містить флуоресцентно мічений дезоксинуклеотид і термінальну дезоксинуклеотидил трансферазу та інкубували при 37 °C впродовж 1 години в темряві. Ядра клітин візуалізували за допомогою 4,6діаміно-2-феніліндолу (DAPI) (Sigma, США) в концентрації 10 мг/л. TUNEL-реакцію детектували, використовуючи конфокальний лазерний скануючий мікроскоп LSM510 МЕТА (Carl Zeiss). Приготовлені зразки досліджували з наступною мультиканальною конфігурацією: - канал для DAP1: збудження діодним лазером ультрафіолетового діапазону (UV) з довжиною хвилі 405 нм (інтенсивність роботи лазера 1015 %), розділяючий фільтр HFT405/488, дзеркало, фільтр емісії ВР 420-480 нм; - канал для візуалізації тетраетил-родаміну (детекція апоптотичних клітин): збудження лазером видимого діапазону світла (VIS) гелій-неонним лазером з довжиною хвилі 543 нм (інтенсивність роботи лазера 65 %), розділяючий фільтр HFT488/543, дзеркало, фільтр емісії LP560; - використовували об'єктив Plan-Apochromat 63*/1,4 Oil DIC. На основі серійних оптичних зрізів, зроблених з інтервалом 0,3-0,5 мкм, будували тривимірні моделі за допомогою програмного забезпечення version 4.0 SP2 (Carl Zeiss, Німеччина). В зразках пухлини РСМ за допомогою TUNELреакції було виявлено збільшення загальної кількості клітин, які загинули шляхом апоптоза (78 %), тобто більше 60 %, що корелювало з позитивною динамікою в клінічній картині. Таким чином, заснована ПХТ була високоефективною. Пояснення до графічних матеріалів корисної моделі Фіг.1. - TUNEL реакція парафінових зрізів пухлини раку сечового міхура (РСМ). а-в - до лікування; г-е - після проведення курсу хіміотерапії; а, г - TUNEL-реакція; б, д - фарбування ядра за допомогою DAPI; в, є - колокалізація зображень TUNEL-реакції та ядер клітин (DAPI). Фіг.2. - TUNEL реакція парафінових зрізів пухлини раку сечового міхура (РСМ). а-в - до лікування; г-е - після проведення курсу хіміотерапії; а, г - TUNEL-реакція; б, д - фарбування ядра за допомогою DAPI; в, є - колокалізація зображень TUNEL-реакції та ядер клітин (DAPI). Джерела інформації: 1. Сапожников А. Г. Гистологическая и микроскопическая техника / А.Г. Сапожников, А.Е. Доросевич: Руководство. - Смоленск: САУ, 2000. 476 с. 2. Клиническая лабораторная аналитика Том II. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории / Под редакцией В. В. Меньшикова - М: Лабинформ-РАМЛД, 1999. - 352 с. 7 3. Letworasirikul Т. A rapid measurement of apoptosis-associated light scatter changes using a hematology analyzer / T. Letworasirikul, A. Bunyaratvej // Cytometry, 2000. - Vol. 42. - P. 215217. 4. Impaired DNA repair as assessed by the "comet" assay in patients with thyroid tumors after a history of radiation therapy:a preliminary study / F. Leprat et al. // Int. J Radiat. Oncol. Biol. Phys. - 1998 Vol. 40. - P. 1019-1026 (прототип). Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 63533 8 5. Detection of apoptotic cells in cytology specimens:an application of TdT-mediated dUTPbiotin nick end labeling to cell smears / H.Sasano et al. // Diagn.Cytopatol. - 1998. - Vol.18. - P. 398-402. 6. Two-color fluorescence detection of Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) cleavage and DNA strand breaks in etoposide-induced apoptotic cells / С Soldani et al. // Eur.J. Histochem. - 2001. Vol. 45. - P. 389-392. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601