Спосіб біотестування речовин різної природи

1. Спосіб біотестування речовин різної природи, що включає підготовку бактерійної суспензії, змішування її з аналізованим зразком, інкубацію, вимірювання інтенсивності світіння фотобактерій і визначення показника ефективної концентрації речовини (ЕК), що інгібує біолюмінесценцію на 50 % у порівнянні з біолюмінесценцією контрольного зразка, який відрізняється тим, що для ре 3 скоротивши при цьому трудомісткість процесу й тривалість його в часі. Поставлена задача вирішується тим, що в способі біотестування речовин різної природи, що включає підготовку бактерійної суспензії, змішування її з аналізованим зразком, інкубацію, вимірювання інтенсивності світіння фотобактерій і визначення показника ефективної концентрації речовини (ЕК), що інгібує біолюмінесценцію на 50 % у порівнянні з біолюмінесценцією контрольного зразка, згідно з корисною моделлю, для реєстрації люмінесценції використовують світлочутливу плівку, на яку накладають матрицю зі світлонепроникного матеріалу з комірками для кювет, кількість яких більше 2, потім проводять експозицію, проявляють, фіксують і сканують світлочутливу плівку з отриманням цифрового зображення, у зонах засвічування якого величина цифрового сигналу пропорційна інтенсивності світіння фотобактерій, потім за цифровим зображенням обчислюють ЕК, за яким судять про токсичність речовини, вважаючи речовину нетоксичною, малотоксичною, токсичною і сильно токсичною при значеннях ЕК відповідно менше 20 %, від 20 % до 50 %, від 50 % до 80 % і більше 80 %, згідно з корисною моделлю, експозицію проводять протягом 1-15 хвилин у залежності від природи токсичного чинника й первинної інтенсивності люмінесценції бактерійної суспензії. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому: використання для реєстрації люмінесцентного сигналу світлочутливої плівки дозволяє знизити трудомісткість процесу й скоротити час аналізу, а використання матриці з кількістю комірок від двох і більше дозволяє одночасно реєструвати біолюмінесценцію великого числа проб, а сканування отриманого зображення та обробка зон засвічування за допомогою комп'ютерної програми дозволяє швидко інтерпретувати дані аналізу. Спосіб полягає в наступному. Морські світні бактерії Photobacterium phosphoreum F2, Vibrio harveyi Ms1, Photobacterium leiognathi Sh1 вирощують протягом 10-16 годин на рідкому живильному середовищі наступного складу: пептон - 5 г/л; дріжджовий екстракт - 2,5 г/л; NaCl - 25 г/л; К2НРО4 7Н2О - 7 г/л; (NH4)2SO4 - 0,5 г/л; MgSO4 - 0,1 г/л; гліцерин - 1 мл/л. Температуру культивування обирають, виходячи з видових особливостей бактерій. Зразок, який досліджують на токсичність, розчиняють або розводять у кюветах люмінометра в 0,9 мл 0,05 моль/л фосфатного буфера, рН=7, що містить 3 % NaCl. До отриманої суміші додають 100 мкл розведення 3 % розчином NaCl суспензії 5 фотобактерій до кінцевої концентрації 5×10 клітин/мл. Для реєстрації біолюмінесцентного сигналу використовують рентгенівську плівку марки AGFA MEDIKAL X-RAY FILM BLUE, розчини проявника (РЕНМЕД-В-Ф) і фіксажу кислого (РЕНМЕД-В-Ф) готують із сухих сумішей шляхом розчинення у дистильованій воді при температурі 40 °C у реко 64811 4 мендованій послідовності. Робоча температура розчинів складає 17-23 °C. Усі роботи з плівкою проводять у темному приміщенні у світлі лампи червоного світла на відстані не менше 1,5 м від неї. Фіксацію інтенсивності світіння проводять у декілька етапів. Готують розчин проявника та фіксажу; встановлюють світлочутливу підкладку на дно світлозахисної оболонки, виконаної у формі прямокутної камери з кришкою, яка щільно закривається; поміщають люмінометричні кювети з досліджуваним розчином і бактерійною суспензією в матрицю з полімерного світлонепроникного матеріалу, яку виготовляють у вигляді бруса, наприклад гумового з розміром 40×100×180 з комірками для люмінометричних кювет. Матрицю фіксують на радіографічній плівці, щільно притискуючи до неї, і витримують у закритій світлонепроникній камері протягом часу, який залежить від інтенсивності люмінесценції бактерійної суспензії. Потім витягують плівку з камери, проявляють її за допомогою проявника, промивають у теплій дистильованій воді й оброблюють за допомогою фіксажу, причому вторинна обробка дистильованою водою повинна бути більш ретельною. Далі висушують при кімнатній температурі й сканують підкладку, обробляють малюнок за допомогою програмного забезпечення IMAGEJ 1.32j, що виводить співвідношення чорних і білих пікселів у зоні засвічування, інтенсивність якого пропорційна біолюмінесцентному сигналу. Співвідношення чорних і білих пікселів у зоні засвічування переводять у відсотки від контрольних значень. Будують калібрувальний графік залежності інтенсивності бактерійного світіння від концентрації токсичного чинника, за яким визначають показник ефективної концентрації речовини ЕК, що інгібує біолюмінесценцію на 50 % - Ек50. Отримане значення показника ефективної концентрації ЕК є показником ступеня токсичності аналізованої речовини, і аналогічно величини Лд50, що використовують в тестах на тваринах. Якщо величина показника ЕК становить менше 20 %, це свідчить про нетоксичність досліджуваної речовини. При величині показника ЕК від 20 % до 50 % речовину вважають малотоксичною, а якщо величина показника ЕК у межах від 50 % до 80 %, то досліджувану речовину вважають токсичною. При величині показника ЕК більше 80 % досліджувану речовину оцінюють як сильно токсичну. Відомості, що підтверджують можливість використання запропонованого способу. Порівняльна оцінка способу-прототипу та запропонованого способу. Використовують штам світних бактерій P. leiognathi Sh1. Оцінюють відтворюваність результатів вимірювання бактерійної біолюмінесценції 30 однакових зразків суспензій світних бактерій P. 8 leiognathi Sq1, що містять 1,55×10 клітин/мл, способом-прототипом у порівнянні з запропонованим способом, час експозиції складає 5 хвилин. З метою з'ясування меж, у яких може бути використаний розроблений спосіб біотестування, 5 64811 визначають інтенсивність свічення бактерій Р. phosphoreum F2, V. harveyi Ms1, P. leiognathi Sh1 при різному розведенні - від 500 до 10000 разів, і проводять порівняльний аналіз даних, отриманих за допомогою способу-прототипу й запропонованого способу. Спосіб ілюстрований наступним графічним зображенням. На кресленні наведена кореляція результатів способу-прототипу й запропонованого способу при розведенні бактерійної культури. Реєстрація біолюмінесцентного сигналу 30 однакових проб суспензій бактерій P. leiognathi Sq1 запропонованим способом і способом-прототипом показує практично повну ідентичність і добру відтворюваність результатів: розбіжність не перевищує 0,2 %; відносна погрішність запропонованого способу складає 2,4 %, а прототипу - 3,3 %. У таблиці 1 наведені статистичні характеристики запропонованого способу та способупрототипу. Мінімальні значення біолюмінесценції, які фіксувалися запропонованим способом при часі експозиції 15 хв., відповідають розведенню бактерій приблизно в 10000 і більше разів для штамів, що яскраво світяться. При цьому розведенні фіксують значення біолюмінесценції від 2 мВ до 480 мВ. Порівняння результатів способу-прототипу і способу, що заявляється, показує наявність строгої кореляції між ними, що характеризується величиною R2=0,980 (Фіг.1). Корисна модель демонструє схожі зі способом-прототипом результати, розбіжність яких не перевищує 0,2 %, і в порівнянні зі способомпрототипом, що заснований на одиничному вимірюванні люмінесцентного сигналу, дозволяє одночасно визначати свічення великої кількості проб і потенційно може бути адаптована для роботи з 96-лунковими імунологічними планшетами. Приклад застосування способу для оцінки біоцидності поверхнево активної речовини додецил сульфату натрію. Використовують штами світних бактерій P. phosphoreum F2, V. harveyi Ms1, P. leiognathi Sh1 і аніонний ПАВ додецил сульфат натрію (ДСН) як токсичний чинник. Здійснюють порівняльне дослідження чутливості способу-прототипу та запропонованого способу за величиною діючої ефективної 6 концентрації ПАВ, інгібуючу біолюмінесценцію на 50 % (Ек50). У таблиці 2 наведено вплив додецил сульфату натрію на біолюмінесценцію фотобактерій. Запропонований спосіб характеризується доброю кореляцією результатів токсичної дії ПАВ на світіння бактерій зі способом-прототипом, різниця в чутливості яких у випадку окремих штамів (V. harveyi Ms1) не перевищує 10 %, і переважає його у швидкості аналізу. Перевага виявляється при тестуванні понад 30 проб, при цьому час, що витрачається на проведення аналізу способомпрототипом, зростає в геометричній прогресії. При аналізі 100 проб запропонований спосіб за тимчасовим показником у 2,5 рази ефективніше за спосіб-прототип, при аналізі 200 проб - у 5 разів, 300 у 7,5 і так далі. Даний спосіб біотестування речовин різної природи дозволяє одночасно в короткочасному режимі визначати свічення великої кількості проб і потенційно може бути адаптований для роботи з багатолунковими імунологічними планшетами, наприклад 96-лунковими планшетами, 192лунковими планшетами і 384-лунковими планшетами. Корисна модель дає можливість оцінювати інтенсивність люмінесценції з двадцятикратною різницею, а мінімальні значення відповідають 1 мВ люмінометра. Чутливість способу до різних речовин може бути додатково збільшена за рахунок збільшення часу експозиції. Запропонований спосіб характеризується високою чутливістю, експресністю, простотою, доступністю стосовно реагентів, застосовністю в польових умовах і може бути рекомендований для використання в практиці екологічних, виробничих, санітарно-гігієнічних і науково-дослідних лабораторій. Даний спосіб дає можливість здійснювати скринінгове біотестування широкого спектра речовин, швидко оцінювати екологічну обстановку, хімічну безпеку, якість води як у лабораторних, так і в польових умовах. Розроблений спосіб може бути використаний для визначення забрудненості природних об'єктів важкими металами, мийними засобами, органічними речовинами, для визначення антибактеріальної, антисептичної, цитотоксичної активності лікарських препаратів, ефективності їх використання в медичній практиці. Таблиця 1 Середнє значення люмінесценції, % Стандартне відхилення Довірчий інтервал Відносна погрішність, % Спосіб-прототип 84,86 5,67 2,03 2,4 Запропонований спосіб 84,72 7,87 2,81 3,3 Таблиця 2 Штам бактерій P. Phosphoreum F2 V. harveyi Ms1 P. leiognathi Sh1 EK50 ДСН, мкг/мл Запропонований спосіб 8 18 5 Спосіб-прототип 17 20 10 7 Комп’ютерна верстка А. Рябко 64811 8 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601