Спосіб визначення токсичності речовин у водних розчинах

Корисна модель стосується хімії, біології, а саме способів визначення токсичності речовин, розчинних у воді. За прототип вибрано спосіб визначення токсичності речовин у водних розчинах [Ribo R.M., Kaiser К. L. E. Photobacterium phosphoreum toxicity bioassay. I. Test procedures and application.// Tox Assess. - 1987. - №2. - P. 305323]; [Bulich A. Tung K., Scheibner G. The luminescent bacteria toxicity test: its potential as an in vitro alternative // J. Biolumin. Chemilumin -1990. -№5. - P. 71-77], який заключається у вимірюванні інтенсивності біолюмінесценції морських світляних бактерій. При цьому ліофільно-висушені або свіжовирощені світляні бактерії видів Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi Vibrio fischeri, Vibrio harveyi розводять в буферному розчині з рН=7, після чого змішують з різними концентраціями або розведеннями аналізованого розчину; після 1030 хвилинної інкубації при температурі 20-25°С вимірюють інтенсивність біолюмінесценції в порівнянні з контролем - суспензією світляних бактерій без добавки аналізованого розчину, результати представляють у вигляді ефективної концентрації речовини, що інгібує біолюмінесценцію на 50% - ЕК50. Ознаками прототипу, загальними з ознаками запропонованого способу, є: змішування розведення морських світляних бактерій з аналізованими розчинами, інкубація їх при температурі 20-25°С, вимірювання інтенсивності біолюмінесценції і порівняння її з контролем. Причинами, які перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату (підвищення чутливості біолюмінесцентного аналізу при визначенні токсичності речовин), є: низька чутливість до деяких класів речовин, таких як неіонні поверхнево-активні речовини і біологічні токсини. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу-прототипу шляхом зменшення рН середовища для розведення світляних бактерій і введения в неї низьких концентрацій катіонних ПАР, що призводить до збільшення чутли вості біолюмінесцентного методу визначення токсичності за рахунок підсилення інгібування бактеріальної люмінесценції токсичними речовинами. Спосіб визначення токсичності речовин у водних розчинах, який заключається в змішуванні розведення морських світляних бактерій з аналізованими розчинами, інкубації їх при температурі 20-25°С; вимірюванні інтенсивності біолюмінесценції і порівнянні її з контролем, згідно корисної моделі, використовують для розведення бактерій середовище з рН=5,5-5,8, що містить неінгібуючі концентрації катіонних поверхневоактивних речовин від 0,4мг/л до 0,6мг/л. Між сукупністю істотних ознак способу, що заявляється, і технічним результатом, який може бути досягнутий, виявляється наступний причинно-наслідковий зв'язок: використання для розведення бактерій середовища з рН=5,5-5,8, що містить неінгібуючі концентрації катіонних поверхнево-активних речовин від 0,4мг/л до 0,6мг/л дозволяє підвищити чутливість біолюмінесцентного методу аналізу токсичності різних речовин, в тому числі неіонних ПАР і мікотоксину Т-2 у водних розчинах. Спосіб заключається в наступному. Світляні бактерії Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi або Vibrio fischeri культивують в режимі постійного перемішування впродовж 16год на рідкому живильному середовищі наступного складу в г/л: пептон - 5; дріжджовий екстракт - 5; NaCl - 30; К2НРO4×7Н2O - 15; (NH4)2HPO4 - 0,5; MgSO 4 - 0,1; СаСО3 - 0,2; гліцерин - 3мл/л. Температуру культивування вибирають, виходячи із видових особливостей бактерій. В кюветах люмінометра БЛМ-8801 - СКТБ «Наука», Росія зразок, досліджуваний на токсичність, розчиняють або розводять в 0,9мл 0,05моль/л фосфатно-цитратного буфера, рН=5,5-5,8, що містить 3% NaCl і 0,5мг/л катіонного ПАР - мірамістин, декаметаксин, етоній. До отриманої суміші додають 100мкл розведеної 3%-м розчином NaCl суспензії світляних бактерій до кінцевої концентрації 5×105 клітин/мл. Після інкубації при кімнатній або іншій температурі впродовж 10-30 хвилин реєструють інтенсивність біолюмінесценції за допомогою люмінометра БЛМ-8801. За отриманими даними будують графічн у залежність інтенсивності біолюмінесценції від концентрації аналізуємої речовини і визначають ефективну концентрацію, інгібуючу біолюмінесценцію на 50% ЕК50. Відомості, які підтверджують можливість використання заявляемого способу. 1. Застосування заявляемого способу для визначення токсичності мікотоксину Т-2. Використовують Чорноморський штам світляних бактерій V.fischeri F 1. На першому етапі визначають дію мікотоксину Т-2 на біолюмінесценцію V.fischeri F1 при нейтральному значенні рН, яке забезпечує максимальний рівень і стабільність свічення бактерій у часі, а потім знижують рН середовища до 5,5-5,8 і вводять в неї катіонну ПАР- мірамістин. Спосіб ілюстрований графічними зображеннями. На Фіг.1 показано вплив Т-2 токсину на біолюмінесценцію V. fischeri F1 при рН=7,0 без добавок мірамістину; концентрації Т-2 мкг/мл: ромб - 0 - контроль, квадрат - 10, трикутник - 25 , хрест - 50. На Фіг.2 показано вплив Т-2 токсину на біолюмінесценцію V. fischeri F1 при рН=5,5, з доданням мірамістину 0,5мг/л; концентрації Т-2 мкг/мл: ромб - 0 -контроль, квадрат - 10, трикутник - 25, крест - 50. На Фіг.3 показана залежність інтенсивності біолюмінесценції V. fischeri F1 від концентрації мікотоксину мкг/мл, I I(%) = t × 100 I0 біолюмінесценція виражена у відносних одиницях мВ і представлялена у відсотках % від контролю , де It - інтенсивність біолюмінесценції проби з мікотоксином, І0 - інтенсивність біолюмінесценції контролю без мікотоксину; час експозиції в хвилинах: ромб - 10, квадрат - 20, трикутник - 30. На Фіг.4 показана залежність інтенсивності біолюмінесценції V. fischeri F 1, вираженою у відносних одиницях I G = 0 -1 It мВ і представленої у вигляді для лінеаризації графічних залежностей, від концентрації мікотоксину мкг/мл, де It - інтенсивність біолюмінесценції проби з мікотоксином, І0 - інтенсивність біолюмінесценції контролю; час експозиції (хвил): ромб - 10, квадрат - 20, трикутник - 30. Збільшення концентрації токсину від 0 до 50мкг/мл при нейтральному значенні рН іпродовж без добавок мірамістину приводить лише до незначних змін біолюмінесценції V. fischeri F 1 впродовж 30хвил, що видно на Фіг.1. Зниження рН до нижньої, фізіологічної для бактерій межі рН=5,5-5,8 дозволяє значно збільшити чутливість способу, що видно на Фіг.2. В ци х умовах відбувається інгібування біолюмінесценції бактерій в залежності від концентрації мікотоксину Т-2 і під час інкубації. Використання запропонованого способу дозволяє визначити ЕК50 мікотоксину, що проілюстровано на Фіг.3 і 4. Порівняно зі способом-прототипом, який не дозволяє визначити ЕK50 мікотоксину, заявляема корисна модель дає можливість заключити, що гостра токсичність цієї сполуки проявляється: при часі інкубації 10хвил ЕК50=12мкг/мл; при часі інкубації 20хвил- EK50=8мкг/мл; і при часі інкубації 30хвил- ЕK50=7мкг/мл. 2. Застосування заявляемого способу для визначення токсичності неіонних ПАР Використовують штамм світляних бактерій V. fischeri F1 і поліоксиетильований нонілфенол n=8,5 ОП-10 в якості неіонної ПАР. Проводять порівняльне дослідження чутливості біолюмінесцентного методу для оцінки токсичності ОП-10. Для цього оцінюють ЕК50 ПАР в біолюмінесцентному тесті при нейтральних значеннях рН (умови прототипу) і при використанні патентуемого способу. В таблиці 1 наведені значення ЕK50 ОП-10 в залежності від часу інкубації при рН середовищі для розведення бактерій 7 і 5,5, в останньому випадку з доданням 0,5мг/л мірамістину. Порівняно зі способом-прототипом, заявляема корисна модель дозволяє збільшити чутливість визначення ОП-10 в 57 (10 хвилинний тест) - 200 (30 хвилинний тест) раз. 3. Застосування заявляемого способу для визначення токсичності ОП-10 в ході очистки води від ПАР. Були досліджені розчини ОП-10 з початковою концентрацією 50мг/л - середній рівень забрудненості більшості промислових стічних вод цими сполуками до і після наступних способів обробки: озонування, одночасна обробка озоном та ультрафіолетом, сорбцію на активованому вугіллі. В ході попередньої окисної обробки розчином озоном або озоном в поєднанні з ультрафіолетом відбувається накопичення перекису водню в поєднанні зі зменшенням концентрації ОП-10. Застосування способу-прототипу при рН=7, в цих умовах, дозволяє оцінити тільки утворення токсичних перекисних продуктів, які з'являються в ході тривалої окисної обробки проб, оскільки сам ОП-10 в цих умовах незначно інгібує свічення бактерій. Використання патентуємого способу із середовищем для розведення з рН=5,5 і доданням 0,5мг/л мірамістину дозволяє додатково визначити зміни токсичності проб в ході всього циклу фізико-хімічної обробки. В процесі окисної деструкції розчинів ОП-10 токсичність у всіх пробах була високою через дію самого ОП-10, продуктів його окислення і перекису водню. Використання біологічно активованого вугілля для адсорбції ОП-10 і продуктів його окислення впродовж 30-50хвил призводить до практично повного зникнення токсичності проб, що супроводжується відновленням бактеріальної біолюмінесценції до вихідного (100%-ого) рівня. В таблиці 2 показані характеристики проб ОП-10 до і після їх обробки при нейтральних значениях рН і при умовах патентуемого способу, де БАВ - біологічно активоване вугілля. На відміну від способу-прототипу заявляємий спосіб дає змогу оцінити зміни токсичності води забрудненої ОП-10 в ході її попередньої очистки деструкцією озоном або озоном в поєднанні з ультрафіолетом, і зниження токсичності в результаті адсорбції ОП-10 і продуктів деструкції на біологічно-активованому вугіллі. Позитивний ефект. Заявляємий спосіб дозволяє підвищити чутливість біолюмінесцентного методу аналізу токсичності різних речовин, в тому числі неіонних ПАР і мікотоксину Т-2 у водних розчинах. Запропонований спосіб характеризується високою чутливістю, простотою і доступністю у відношенні реагентів і може бути використаний в практиці екологічних, виробничих, санітарно-гігієнічних і науково-дослідних лабораторій. Таблиця 1 Час 10 хвил 20 хвил 30 хвил ЕК50 ОП-10, мг/л рН=5,5, з доданням мірамістину 0,5 мг/л 1,4 1,2 0,3 рН=7,0 80 70 60 Таблиця 2 Характер обробки ОП-10 до обробки О3, хвил 4 10 33 48 48 03/УФ, хвил 4 9,5 10 28 ОП-10мг/л рН Н2O2,мг/л Біолюмінесценція, % рН=5,5 рН=7,0 (б/р) Розведення 1:2 72,3 5,2 (б/р) 50,00 5,9 0,0 0,1 14,80 7,10 14,25 5,00 11,00 5,0 4,8 5,1 4,8 6,8 2,0 2,0 3,1 4,0 0,0 97,9 54,5 83,3 11,3 1,8 20,7 18,5 22,2 18,5 1,5 0,1 2,5 4,2 0,1 0,1 16,00 40,00 6,50 13,50 5,0 5,6 4,3 4,7 3,8 0,0 6,0 1,3 83,3 83,3 92,2 83,3 11,9 5,9 17,0 8,9 0,1 0,1 0,1 0,1 47 УФ, хвил 47 БАВ, хвил 30 50 100 10,80 4,5 2,5 7,2 5,2 7,5 40,00 5,8 0,0 98,0 17,8 5,0 105,8 103,2 122,6 102,0 95,5 92,3 105,0 108,0 88,0