Спосіб оцінки ступеня негативного впливу нітритів на організм свиней

Спосіб оцінки ступеня негативного впливу нітритів на організм свиней, який базується на аналізі системи антиоксидантного захисту за активністю ферментів крові, який відрізняється тим, що додатково визначають ферментну активність глутатіонпероксидази та супероксиддисмутази і за комплексною картиною активності ферментів судять про ступінь негативного впливу нітратного навантаження, при цьому: тварин, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв на мг білка, глутатіонпе U 1 3 гічних показників у крові тварин (кількість гемоглобіну, метгемоглобіну, еритроцитів, лейкоцитів, аналіз лейкограм, концентрацію в крові нітратів і нітритів, загальний білок, сечовину, цукор, інсулін). Ці способи включають комплексний підхід до оцінки патології різних ступенів важкості, але оскільки нітрити проявляють подвійну дію, а, саме, метгемоглобіноутворюючу дію та утворення вільних радикалів, зазначенні показники гематологічних досліджень не дозволяють оцінити ступінь впливу нітритів на організм свиней. Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, є спосіб визначення стану антиоксидантної системи при нітратному навантаженні: Гуфрий Д.Ф. Нитраты и активность ферментов // Тез. докл. науч. конф. Казан. Вет. ин-та. "Экологические проблемы фармакологии и токсикологии", Казань, 1990.- С. 25. Спосіб полягає у визначенні в крові свиней при нітратно-нітритному навантаженні активності фермента каталази. За каталазою оцінюють стан системи антиоксидантного захисту організму свиней за нітратно-нітритного токсикозу. При цьому: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв на мг білка, вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв на мг білка, вважають частково пораженими впливом нітратів та нітритів, які потребують корекції системи антиоксидантної антиоксидантного захисту організму; - тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв на мг білка, вважають пораженими впливом високого рівня нітратів та нітритів у кормах і з явищами незворотного порушення обміну речовин. Недоліком даного способу є недостатня його точність, оскільки він не повністю відображає стан антиоксидантної системи крові свиней тому, що за одним показником важко судити про стан антиоксидантної системи організму при нітратнонітритному токсикозі. Заявлений нами спосіб усуває недоліки і повністю відображає стан антиоксидантної системи крові свиней і забезпечує об'єктивну оцінку негативного впливу нітритів на організм свиней. В основу корисної моделі поставлена задача розробити ефективний і об'єктивний спосіб виявлення і оцінки ступеню негативного впливу нітратів і нітритів на організм свиней, зручний і доступний у застосуванні, економічно вигідний для господарств, у яких він застосовується. Поставлена задача вирішується тим, що для оцінки стану системи антиоксидантного захисту за активністю ферментів крові додатково визначають ферментну активність глутатіонредуктази, глутатіонпероксидази та глюкозо-6-фосфатдегідрогенази і за комплексною картиною активності ферментів судять про ступінь негативного впливу нітратного навантаження на організм свиней, при цьому: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв на мг білка, глутатіонпероксидази в межах 35,81-36,15 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисму 65511 4 тази - в межах 33,80-36,00 УО/хв. на 1 мг білка, вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв на мг білка, глутатіонпероксидази - в межах 25,5-34,0 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв на 1 мг білка, вважають частково ураженими впливом нітратів та нітритів, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму шляхом застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв на мг білка, глутатіонпероксидази є меншою 20,0 нмоль нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв на 1 мг білка, вважають ураженими впливом високого рівня нітратів і нітритів у кормах ї з явищами незворотного порушення обміну речовин, що підлягають вибраковці. Технічний результат заявленого способу обумовлений впливом ферментів антиоксидантного захисту, яку вони відіграють в обміні речовин та зміною їх активності під впливом навантаження нітратами та нітритами. Каталаза відновлює Н2О2 до води. До активного центру ферменту входить тривалентне залізо, протопорфірин, який взаємодіє з перекисом водню за каталазним або по пероксидазним механізмом, в залежності від концентрації субстрату. Глутатіонпероксидаза - каталізує розклад гідроперекисів ліпідів нерадикальним шляхом за допомогою глутатіону відновленого, а саме каталізує розпад перекису водню і окиснює глутатіон. Глутатіонпероксидаза разом з іншими антиоксидантами сприяє видаленню первинних продуктів частково редукованого кисню. Супероксиддисмутаза - це ключовий фермент антирадикального захисту. Вона дисмутує супероксидрадикал до менш токсичного перекису водню. Залежно від мікроелементу, що знаходиться в активному центрі ферменту, виділяють Fe-, Zn-Cuта Mn-залежні СОД. Метали виконують каталітичну функцію. Вони послідовно відновлюються і окиснюються в активному центрі ферменту. Feзалежна СОД у більшій кількості знаходиться в еритроцитах, Zn-Cu-залежна - у цитоплазмі, а Мпзалежна - у мітохондріях. Дія нітритів на організм тварин супроводжується утворенням в крові метгемоглобіну, де двовалентне залізо гемоглобіну окиснюється до тривалентного. Процес окиснення гемоглобіну реалізується через взаємодію його оксиформи з нітрит-іоном по ланцюговому шляху. При окисненні гемоглобіну утворюється цілий ряд радикальних метаболітів, які є активними окисниками біологічних субстратів, надають виражену цитотоксичну дію, ініціюють процеси перекисного окиснення ліпідів. В процесі окиснення оксигемоглобіну активні форми кисню включаються як безпосередні учасники елементарних стадій, продуценти токсичного для організму перекису водню, також які приймають участь в реакціях окиснення оксигемоглобіну. Даному патологічному процесу запобігає багатокомпонентна система антиоксидантного захисту організму. Велику роль відіграє каталаза, глутатіо 5 65511 нова система (глутатіонпероксидаза), супероксиддисмутаза. Отже, зазначений нами спосіб забезпечує більш точну оцінку ступеню негативного впливу нітратів і нітритів на організм свиней. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином: У тваринницьких господарствах в умовах нітратно-нітритного навантаження, одержуючи тривалий час корми з підвищеною кількістю нітратів для виявлення і оцінки ступеню негативного впливу нітратів і нітритів на організм свиней відбирають кров у тварин різних вікових груп. У крові визначають: каталазу (за методом Баха і Зубкової), глутатіонпероксидазу (за методом В.В. Лемешко і ін., Н. Siens), супероксиддисмутазу (за методом Чеварі). Аналіз одержаних результатів здійснюють наступним чином: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв на мг білка, глутатіонпероксидази в межах 35,81-36,15 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 33,80-36,00 УО/хв. на 1 мг білка, вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв на мг білка, глутатіонпероксидази - в межах 25,5-34,0 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв на 1 мг білка, вважають частково ураженими впливом нітратів та нітритів, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму шляхом застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв х мг білка, глутатіонпероксидази є меншою 20,0 нмоль нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв на 1 мг 6 білка, вважають пораженими впливом високого рівня нітратів і нітритів у кормах із явищами незворотного порушення обміну речовин, що підлягають вибраковці. Приклад конкретного виконання Ефективність заявленого способу та його переваги перед прототипом підтверджені прикладом конкретного виконання. У господарстві ДП "Молочні ріки" ТзОВ "Правда" Буського району, Львівської області було відібрано 30 поросят великої білої породи тримісячного віку. Було створено 6 груп по 5 тварин у кожній. Тварини контрольної групи знаходились на звичайному раціоні, згідно з нормами ВІТА. Тваринам дослідних груп створювали штучно нітратне навантаження, а саме: Дослідна 1 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,2 г NO3 /кг маси тіла один раз на добу протягом місяця; Дослідна 2 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,3 г NO3 /кг маси тіла один раз на добу протягом місяця; Дослідна 3 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,4 г NO3 /кг маси тіла; Дослідна 4 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,5 г NO3 /кг маси тіла; Дослідна 5 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,6 г NO3 /кг маси тіла. Кров для аналізу брали з краніальної порожнистої вени на 1,3, 6,9 годину після згодовування нітрату натрію. Активність глутатіонпероксидази визначали за методикою В.В. Лемешко і ін., активність супероксиддисмутази визначали за методом Чеварі, активність каталази - за методикою Бака і Зубкової. Основні показники активності ферментів як дослідних так і контрольної груп подані у таблицях 1 і 2. Таблиця 1 Активність ферментів контрольної групи Активність ферментів Одиниці виміру Глутатіонпероксидаза Супероксид35,0±1,4 циемутаза 34,48±1,2 Каталаза 1,35±0,08 При цьому за прототипом у тварин всіх груп визначали активність каталази. Так, у тварин контрольної групи активність каталази була в межах 1,29-1,40 нмоль/хв на мг білка. При згодовуванні нітрату натрію у різних дозах активність каталази почала знижуватись, а саме при згодовуванні нітрату натрію у дозах 0,2 і 0,3 NO3 /кг маси тіла активність каталази коливалася у межах 1,18-1,28 нмоль/хв на мг білка, при дозах 0,4-0,6 г NO3 /кг маси тіла - у межах 0,70-1,05 нмоль/хв на мг білка. На підставі даних активності каталази важко робити висновок про ступінь негативного впливу нітратів і нітритів на систему антиоксидантного захисту організму свиней. При додатковому визначенні активності ферментів глутатіонпероксидази та супероксиддисмутази, ступінь негативного впливу нітратного наван нмоль/хв на мг білка УО/хв на 1 мг білка нмоль/хв на мг білка таження на організм свиней проявляється більш повно. Так у тварин контрольної групи показники активності ферментів знаходилися в межах: глутатіонпероксидази 35,81-36,15 нмоль/хв на мг білка, супероксиддисмутази 33,80-36,00 УО/хв на 1 мг білка. Згідно з даними таблиці у дослідних тварин, яким згодовували нітрат натрію у різних дозах, показники активності ферментів системи антиоксидантного захисту організму свиней мали певні відхилення. Так, із збільшенням дози нітрату натрію активність ферментів знижувалась. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,2 г NO3 /кг маси тіла, показники активності знаходилися у таких межах: глутатіонпероксидази 34,0-35,98 нмоль/хв на мг білка, супероксиддисмутази 29,68-34,48 УО/хв на 1 мг білка. 7 65511 У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,3 г NO3 /кг маси тіла, показники активності знаходилися у таких межах: глутатіонпероксидази 25,4-34,81 нмоль/хв на мг білка, супероксиддисмутази 27,10-30,3 УО/хв на 1 мг білка. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,4 г NO3 /кг маси тіла, показники активності знаходилися у таких межах: глутатіонпероксидази 23,54-30,25 нмоль/хв на мг білка, супероксиддисмутази 20,48-29,45 УО/хв на 1 мг білка. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,5 г NO3 /кг маси тіла, показники активності знаходилися у таких межах: глутатіонпероксидази 19,9-28,98 нмоль/хв на мг білка, супероксиддисмутази 18,80-27,48 УО/хв на 1 мг білка. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,6 г NO3 /кг маси тіла, показники активності знаходилися у таких межах: глутатіонпероксидази 19,3-27,87 нмоль/хв на мг білка, супероксиддисмутази 18,35-25,87 УО/хв на 1 мг білка. Таким чином при активності ферментів крові: каталази, глутатіонпероксидази, супероксиддис 8 мутази можна вважати, що тварини, які одержували з кормом нітрат натрію у дозах 0,2-0,3 г NO3 /кг маси тіла - це тварини, у яких активність активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв на мг білка, глутатіонпероксидази - в межах 25,5-34,0 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв на 1 мг білка, вважають частково ураженими впливом нітратів та нітритів, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму, застосуванням природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів. А тварини, які одержували з кормом нітрат натрію у дозах 0,4-0,6 г NO3 /кг маси тіла це тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв на мг білка, глутатіонпероксидази є меншою 20,0 нмоль нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв на 1 мг білка, вважають ураженими впливом високого рівню нітратів і нітритів у кормах із явищами незворотного порушення обміну речовин. Таблиця 2 Активність ферментів свиней за нітратного навантаження Доза г Активність ферментів NO3/кг Після введення препарату через (годин) 1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Глутатіонпероксидаза Супероксидцисмутаза Каталаза (прототип) Глутатіонпероксидаза Супероксиддисмутаза Каталаза (прототип) Глутатіонпероксидаза Супероксиддисмутаза Каталаза (прототип) Глутатіонпероксидаза Супероксиддисмутаза Каталаза (прототип) Глутатіонпероксидаза Супероксиддисмутаза Каталаза (прототип) 3 6 9 35,98±1,334,48±1,2 35,76±1,232,56±1,1 34,0±1,129,68±1,2 35,24±1,232,35±1,2 1,33±0,08 1,31±0,08 1,28±0,08 1,30±0,08 34,81±1,230,30±0,9 30,13±1,029,68±1,2 25,4±1,027,10±1,2 33,81±1,230,05±1,1 1,31±0,07 1,24±0,08 1,18±0,08 1,25±0,08 30,25±1,129,45±1,2 26,40±1,025,83±0,9 23,54±1,020,48±1,0 28,34±1,227,15±1,0 1,25±0,07 1,19±0,07 1,10±0,06 1,20±0,08 28,98±1,227,48±1,1 23,12±1,220,18±1,2 19,9±0,618,80±0,7 27,10±1,122,48±1,2 1,19±0,06 1,05±0,08 0,88±0,6 1,02±0,07 27,87±1,225,87±1,0 1,02±0,06 22,3 5±1,219,48±1,0 0,87±0,08 19,3±1,118,35±0,8 26,45±1,320,88±1,0 0,70±0,08 0,85±0,08 Отже, заявлений спосіб є точним і об'єктивним і дозволяє виявити ступінь негативного впливу нітратного навантаження на організм свиней. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601