Спосіб культивування мультипотентних стовбурових клітин – похідних нервового гребеня з бульбарного регіону волосяного фолікула дорослих ссавців

Спосіб культивування мультипотентних стовбурових клітин - похідних нервового гребеня з бульбарного регіону волосяного фолікула дорослих ссавців, який включає мікрохірургічну ізоляцію бульбарних регіонів та культивування їх на обробленій колагеном поверхні в ростовому середовищі, який відрізняється тим, що як базальне середовище використовують DMEM:F12 з додаванням 1 % поживної добавки В27 та 1 % стократного розчину вітамінів MEM з проведенням подальшого субкультивування. (19) (21) u201106227 (22) 18.05.2011 (24) 26.12.2011 (46) 26.12.2011, Бюл.№ 24, 2011 р. (72) ВАСИЛЬЄВ РОМАН ГЕННАДІЙОВИЧ, РОДНІЧЕНКО АНЖЕЛА ЄВГЕНІВНА, ЛАБУНЕЦЬ ІРИНА ФЕДОРІВНА, БУТЕНКО ГЕННАДІЙ МИХАЙЛОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ГЕНЕТИЧНОЇ ТА РЕГЕНЕРАТИВНОЇ МЕДИЦИНИ НАМН УКРАЇНИ" 3 бріонального курячого екстракту (Sieber-Blum M. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle / M. Sieber-Blum // Dev. Dynamics. -2004. Vol. 231. - P.258-269). У цьому випадку на третю добу культивування починається інтенсивна еміграція та проліферація МСК-ПНГ. Після отримання достатньої для подальшого культивування кількості клітин експлантати вилучають. Проміжок часу, в який необхідно вилучати експлантати є варіабельним (7-9 діб культивування). Передчасне вилучення експлантатів з первинної культури (5-7 доба) не дозволяє одержати достатню кількість МСКПНГ для їх подальшого культивування, а тривале культивування експлантатів значно підвищує ймовірність контамінації культур кератиноцитами. Однак запропонований авторами спосіб культивування має істотні недоліки: 1) використання трудомісткого в одержанні та нестандартизованого компонента середовища курячого ембріонального екстракту; 2) ростове середовище, що описане, не є селективним для МСК-ПНГ та підтримує ріст кератиноцитів, що призводить до контамінації культур клітинами даного типу. При цьому критичним моментом для одержання чистих культур МСК-ПНГ є своєчасне вилучення експлантатів у інтервалі часу між еміграцією МСК-ПНГ та початком проліферації кератиноцитів. В основу запропонованої нами даної корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб культивування мультипотентних стовбурових клітин - похідних нервового гребеня з бульбарного регіону волосяного фолікула дорослих ссавців шляхом заміни складу повного ростового середовища з вилученням нестандартизованого компонента (курячого ембріонального екстракту), що дозволить одержувати чисті культури (без контамінації кератиноцитами). Поставлена задача вирішується тим, що в способі, який включає мікрохірургічну ізоляцію бульбарних регіонів та культивування їх на обробленій колагеном поверхні в ростовому середовищі, згідно з даною корисною моделлю, як базальне середовище використовують DMEM:F12 з додаванням 1 % поживної добавки В27 та 1 % стократного розчину вітамінів MEM. Новизна даного рішення полягає в тому, що як базальне середовище замість МЕМ автори використовують DMEM:F12 з додаванням замість 5 % курячого ембріонального екстракту 1 % поживної добавки В27 та 1 % стократного розчину вітамінів MEM, що дозволяє одержати чисті культури (без контамінації кератиноцитами). Крім того, з його 66086 4 складу вилучається складний в отриманні та нестандартизований компонент (курячий ембріональний екстракт). Спосіб здійснюється наступним чином. Ізоляція ВФ та одержання експлантатів бульбарного регіону здійснюється згідно з методом М. Sieber-Blum (Sieber-Blum M. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle / M. Sieber-Blum // Dev. Dynamics. - 2004. - Vol. 231. - P.258-269.). Експлантати поміщають у покритий колагеном культуральний посуд. Після прикріплення експлантатів протягом години їх заливають повним ростовим середовищем. При цьому, дане ростове середовище містить базальне середовище DMEM:F12, 10 % ембріональної телячої сироватки, 1 % поживної добавки В27 (за формулою Bottenstein and Sato; Bottenstein J.E. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium / J.E. Bottenstein and G.H. Sato // PNAS. - 1979. - Vol.76. P. 514-517.) та 1 % стократного розчину вітамінів MEM. Через добу проводиться заміна половини середовища. В подальшому ростове середовище змінюють 2-3 рази на тиждень в залежності від швидкості росту культури. Через 48-72 години після початку культивування спостерігається міграція клітин з експлантату. Первинна культура росте 11 діб до отримання кількості клітин, достатньої для подальшого субкультивування. Після цього експлантати вилучають та клітини пересівають в покритий колагеном культуральний посуд. В подальшому культуру (у міру досягнення субконфлуентного стану) пасерують з коефіцієнтом 1:10. За місяць культивування з одного бульбарного експлантату одержують до 50 млн. клітин (3-й пасаж). Клітини добре ростуть включно до 15-го пасажу. При цьому за морфологічними ознаками, міграційною активністю та проліферативному потенціалу клітини, які вирощують при даному способі культивування відповідають МСК-ПНГ з бульбарного регіону волосяного фолікула, які були описані раніше. Таким чином, як видно з табл., використання запропонованого способу дозволяє відтворювано одержувати чисті культури МСК-ПНГ від експериментальних тварин різних ліній та віку. МСК-ПНГ характеризуються значним проліферативним потенціалом, здатністю до росту за умов клональної щільності та самовідновленням при їх субклонуванні. Мультипотентність даного типу клітин була підтверджена їх здатністю до диференціювання у остеогенному та адипогенному напрямках (Фіг. 1, 2). 5 66086 6 Таблиця Отримання культур МСК-ПНГ з бульбарного регіону волосяного фолікула мишей різних ліній та віку Лінія мишей Вік (міс) СВА СВА СВА FVB FVB FVB С57b1/6 3 6 12 3 6 12 3 Кількість діб перебування Кількість експланта- Кількість експлантатів, Кількість експлаексплантатів в первинній тів, які дали ріст які дали ріст кератинонтатів культурі МСК-ПНГ* цитам 11 20 20 0 11 15 14 0 11 20 17 0 11 20 20 0 11 21 19 0 11 15 12 0 11 21 21 0 * Відсутність росту пов'язана або з відкріпленням експлантату на початку культивування, або зі значним пошкодженням бульбарного регіону під час ізоляції. 7 Комп’ютерна верстка Мацело В. 66086 8 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601