Спосіб визначення цитотоксичної дії лікарських засобів з магнітокерованими властивостями

Спосіб визначення цитотоксичної дії лікарських засобів з магнітокерованими властивостями 3 засобів, в якому за допомогою постійного магніту досягається розшаровування речовини чорного кольору, що досліджується, (непрозорої фази) і кліткової суспензії червоного кісткового мозку щурів (прозорої фази), що дозволяє визначити зміни у співвідношенні "живих" і "мертвих" клітин методом світлової мікроскопії при забарвленні метиленовою синню. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі визначення цитотоксичної дії лікарських засобів з магнітокерованими властивостями шляхом додавання до досліджуваного зразка клітинної суспензії червоного кісткового мозку щурів з подальшим визначенням за допомогою світлової мікроскопії живих і пошкоджених клітин у нативному мазку, забарвленому метиленовою синню, відповідно до корисної моделі передбачено, що після додавання клітинної суспензії червоного кісткового мозку щурів зразок, що досліджується, піддають зовнішній дії поля постійного магніту протягом 2-20 хвилин до розшарування прозорої та непрозорої фаз. Розшаровування зразків магнітних лікарських засобів (непрозорої фази) і клітинної суспензії червоного кісткового мозку щурів (прозорої фази) за допомогою постійного магніту засноване на особливих магнітних властивостях магнітних лікарських засобів. Час, який необхідний для розшаровування зразків магнітних лікарських засобів і клітинної суспензії червоного кісткового мозку щурів за допомогою постійного магніту, визначається експериментально та залежить від магнітних характеристик як постійного магніту, так і магнітних лікарських засобів. Використання постійного магніту при вивченні цитотоксичної дії магнітних лікарських засобів невідомо з літературних джерел. Спосіб здійснюється таким чином: На початку експерименту зразки магнітних лікарських засобів густої консистенції чорного кольору за допомогою дозатора вміщують у планшетку та методом перекатки зменшують дози в 2,4, 16,64 рази. Потім тим самим дозатором у кожній чарунці клітинну суспензію червоного кісткового мозку щурів нашаровують на зразки магнітних лікарських засобів та через 15,30,60 і 90 хвилин планшетку ставлять на постійний магніт. Під дією зовнішнього магнітного поля через 2-20 хвилин (час визначається експериментально та залежить від магнітних характеристик постійного магніта і магнітних лікарських засобів) відбувається розшаровування досліджуваної речовини і клітинної суспензії червоного кісткового мозку щурів. Контроль цитотоксичного ефекту проводять методом світлової мікроскопії. Для визначення у нативному мазку кількості клітин ("живих" - без порушення цілісності мембран та "мертвих" - з порушенням цілісності і проникливості мембран) використовують метиленову синь. Клітини, які забарвлюються у синій колір, оцінюються як "мертві". У кожному експерименті підраховують 100 клітин. Клітини червоного кісткового мозку щурів у фізіологічному розчині використовують як негативний контроль. Одержані експериментальні результати 66526 4 статистично обробляють методом варіаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента [6]. Корисна модель ілюструється прикладом. Приклад 1. За заявленим засобом було здійснено визначення цитотоксичної дії магнітокерованого рентгеноконтрастного засобу [7] у Проблемній лабораторії морфофункціональних досліджень НФаУ за допомогою біотестів у культурі клітин in vitro. В експерименті досліджувались наступні зразки: №1 - комплексний магнітокерований рентгеноконтрастний засіб [7] складу: барій гексаферит 30 % "Тріомбраст" 56 % 3 % водний розчин пектину 14 %. Намагніченість насичення цієї композиції Is при 300 К - 19 кА/м. №2 - синтезований барій гексаферит (намагніченість насичення Is при 300 К -300 кА/м) [8]. №3 - препарат "Тріомбраст" (ОАО Фармак, Україна) серія 141107 [9]. №4-пектин (ДОСТ 29186-91) [10]. Дослідження проводили з використанням клітин червоного кісткового мозку щурів, які одержували шляхом вимивання фізіологічним розчином на холоді. На початку експерименту розчини, що досліджувались, за допомогою дозатора вміщували у планшетку та методом перекатки зменшували дози у 2,4, 16,64 рази. Потім тим самим дозатором у кожну чарунку вносили рівні об'єми клітинної суспензії червоного кісткового мозку щурів. Враховуючи, що зразки №1 та №2 мають густу консистенцію чорного кольору і не розчиняються у фізіологічному розчині, клітинну суспензію червоного кісткового мозку нашаровували на ці зразки та через 15,30,60 і 90 хвилин планшетки ставили на постійний магніт Н35В-М, який мав форму призми розміром 50 ммх30 мм* 10 мм. Згідно з ТУ У 21174514.001-96 постійний магніт Н35В-М має наступні магнітні параметри: залишкова індукція Вг - 0,9 Тл; коерцитивна сила НсВ - 600 кА/м. Під дією зовнішнього магнітного поля через 2 хвилини для зразка №2 та через 10 хвилин для зразка №1 (час визначено експериментально) відбувалося розшаровування досліджуваної речовини і клітинної суспензії червоного кісткового мозку щурів. Контроль цитотоксичного ефекту проводили методом світлової мікроскопії. Для визначення у нативному мазку кількості клітин ("живих" - без порушення цілісності мембран та "мертвих" - з порушенням цілісності і проникливості мембран) використовували метиленову синь. Клітини, які забарвлювались у синій колір, оцінювались як "мертві". У кожному експерименті підраховували 100 клітин. Клітини червоного кісткового мозку щурів у фізіологічному розчині використовували як негативний контроль. Одержані експериментальні результати статистично обробляли методом варіаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента. Результати дослідження цитотоксичності випробовуваних зразків за заявленим способом наведені у табл. 1 і табл. 2. 5 66526 6 Таблиця 1 Цитотоксичність зразків №1 і №3 на клітини червоного кісткового мозку щурів Контроль кі- Ступінь розведення зразка №1 кількість Ступінь розведення зразка №3 кількість "мертвих" клітин, % Час, хв. лькість "мерт- "мертвих" клітин, % вих" клітин, % 76 38 19 76 38 19 15 2,4±0,3 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 30 3,5±0,5 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 60 5,1±0,8 1,0±0,1 0±0 0±0 1,1±0,1 0±0 0±0 90 6,7±0,7 1,2±0,1 0,9±0,01 0±0 1,2±0,1 0,7±0,03 0±0 Таблиця 2 Цитотоксичність зразків №2, №4 на клітини червоного кісткового мозку щурів Час, хв. 15 30 60 90 Контроль, клітин, % кількість 2,4±0,3 3,5±0,5 5,1±0,8 6,7±0,7 "мертвих" Зразок №2, кількість "мерт- Зразок №4, кількість "мертвих" клітин, % вих" клітин, % 1,9±0,6 2,1±0,4 3,7±0,3 3,0±0,5 5,0±0,5 4,9±0,7 6,1±0,4 6,2±0,5 Аналіз отриманих результатів дозволив зробити висновки: 1. Усі зразки, що досліджувались на моделі клітин червоного кісткового мозку щурів, не виявили цитотоксичного ефекту. 2. Кількість клітин, що пошкодились, у зразках №2, №4 була на рівні контролю залежно від часу контакту з клітинами. 3. Одержані результати при дослідженні зразків №1 і №3 свідчать на користь цитопротекторної дії останніх на клітини червоного кісткового мозку щурів. У контрольних пробах, де клітини були суспендовані у фізіологічному розчині, залежно від часу контакту спостерігалось збільшення пошкоджених клітин: через 15 хв.-2,4±0,3, через 30 хв.3,5±0,5, через 60 хв.-5,1±0,8, а через 90 хв.6,7±0,7. У той же час клітини, що були суспендовані у випробовуваних зразках №1 і №3, залишались непошкодженими протягом 30 хвилин, і тільки через 60 хвилин біоконтакту було зафіксовано клітини, що пошкодились. 4. Магнітокерований рентгеноконтрастний засіб не виявив цитотоксичної дії в дослідах in vitro. Таким чином, розроблений спосіб визначення цитотоксичної дії магнітних лікарських засобів з застосуванням постійного магніту для розшаровування зразків лікарських засобів чорного кольору з магнітними властивостями і клітинної суспензії червоного кісткового мозку щурів дає можливість визначити зміни у співвідношенні "живих" і "мертвих" клітин методом світлової мікроскопії та провести ефективний та достовірний контроль цитотоксичного ефекту магнітних лікарських засобів, що може бути одним із перших методів мікробіологічного аналізу in vitro нових магнітних лікарських засобів у межах доклінічних випробувань. Джерела інформації: 1.Wilfried A. Magnetism in medicine/A.Wilfried, W. Andra, H. Nowak. - Berlin: Wiley-VCH, 2006. P.320-331. 2. Беликов В.Г. Получение и медикобиологическое использование магнитных полей и носителей / В.Г. Беликов, А.Г. Курегян // Хим.фармац. журн.-2001. - Т.35, № 2. - С. 27-34. 3.Blaauboer B.J.Toxicodynamic modelling and the interpretation of in vitro toxicity data. // Toxicology Letters-2001-Vol.120-P.117-123. 4. Малышева М.В., Рязанова Р.А. Клеточные культуры - модельная тест-система в токсикологогигиенических исследованиях. // Тезисы докладов. 1-ый съезд токсикологов России 17-20 ноября 1998г. / Под ред. проф. Б.А.Курляндского. - М., 1998. - С. 297. 5. Маркова В.М. Модификация метода Шрека для определения антитоксической активности препаратов и вновь синтезированных соединений // Тез. Докл. III сьезда фармацевтов Туркменской ССР. - Ашхабад, 1987. - С. 225-226. 6. Теорія ймовірностей і статистичні методи обробки результатів спостережень / Б.В. Горбуненко, Ф.Г. Дягілева, Г.В. Жиронкіна та ін. -X.: Вид-во НФаУ: Золоті сторінки, 2002. - С 95-100. 7. Патент на винахід № 90577 Україна, МПК (2009) А61К 49/04. Магнітокерований рентгеноконтрастний засіб / Є.Я. Левітін, А.О. Коваль, Т.О. Онопрієнко, І.О. Ведерникова, О.Л. Алтухов; заявник і патентовласник НФаУ. - Заявл. 28.07.2008; опубл. 11.05.2010, Бюл. № 9. 8. Левитин Е.Я., Коваль А.А., Цихановская И.В. и др. Изучение реакции получения гексаферрита бария - основного компонента магнитных коллоидов для фармацевтической промышленности // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики. - Запоріжжя: ЗДМУ, 2006. Вип. XV, Т.1. - С. 161-166. 7 9. Компендиум. Лекарственные препараты 2007 / Под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Викторова. К.: МОРИОН, 2007. - Т.2. - С. С-158. Комп’ютерна верстка І. Скворцова 66526 8 10. Лазарева Е.Б., Меньшиков Д.Д. Опыт и перспективы использования пектинов в лечебной практике // Антибиотики и химиотерапия.-1999. № 2. - С. 37-40. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601