Спосіб визначення цитотоксичності лікарських засобів

Спосіб визначення цитотоксичності лікарських засобів за допомогою клітинного біосенсора Dunaliella viridis, який відрізняється тим, що оцінюють морфологічні та функціональні зміни водорості Dunaliella viridis і розраховують коефіцієнти морфологічної, функціональної та загальної цитотоксичності та при значенні коефіцієнта загальної токсичності більше 1,0 вважають досліджувану дозу лікарського засобу токсичною. (19) (21) u200810145 (22) 06.08.2008 (24) 25.02.2009 (46) 25.02.2009, Бюл.№ 4, 2009 р. (72) КОЗАР ВАЛЕНТИНА ВІКТОРІВНА, U A, ПОЛТОРАК ВІКТОРІЯ ВІТАЛІЇВН А, U A, БОЖКОВ АН АТОЛІЙ ІВАНОВИЧ, UA, КЛІМОВА ОЛЕНА МИХАЙЛІВН А, U A (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЕНДОКРИННОЇ ПАТОЛОГІЇ ІМ. В.Я. ДАНИ 3 39323 Поставлена задача вирішується тим, що визначення цитотоксичності ЛЗ проводять шляхом оцінки їх впливу на синхронізовану культур у Dunaliella viridis, і в залежності від зміни функціонального та морфологічного стану біосенсору розраховують коефіцієнти морфологічної, функціональної та загальної цитотоксичності. Технічний результат - розширення спектру використання біосенсору Dunaliella viridis для оцінки токсичності ЛЗ, що дозволяє зменшити використання лабораторних тварин, стандартизувати метод, оперативно одержувати інформацію та зменшити собівартість досліджень для оцінки загальної токсичності сполук. В якості біосенсору використовують синхронізовану культур у одноклітинної водорості Dunaliella viridis віком 18-21 день. Клітини на 18-21 день культивування центрифугують, надосадову рідину видаляють і ресуспендують в чистому середовищі Артарі до кінцевої концентрації 15млн. клітин в 1мл. Для оцінки цитотоксичності ЛЗ в лунки планшета вносять 50мкл клітинної тест-системи і 50мкл досліджуваного ЛЗ в певній концентрації. Після 30 хвилинної інкубації при кімнатній температурі проводять підрахунок відсотку клітин, що змінили морфологічні та функціональні властивості і порівнюють із контрольною культурою. В якості контролю використовують референтні величини, одержані при внесенні в культур у розчинника ЛЗ. Розраховують коефіцієнт морфологічної та функціональної цитотоксичності за формулами, приведеними нижче. Коефіцієнт морфологічної цитотоксичності розраховують за формулою: M - M0 Km = 1 , n де М1 - відсоток клітин зі зміненою конфігурацією у досліді, М0 - відсоток клітин зі зміненою конфігурацією в контролі n - спонтанний рівень змін (рівний 10) Коефіцієнт функціональної цитотоксичності розраховують за формулою: F -F Kf = 1 0 , n де F1 - відсоток клітин зі зміненими функціональними властивостями у досліді, F0 - відсоток клітин зі зміненими функціональними властивостями в контролі n - спонтанний рівень змін (рівний 10) На основі отриманих даних вираховують коефіцієнт загальної (сумарної) цитотоксичності за формулою: K= Km + Kf , 2 де Km - коефіцієнт морфологічної цитотоксичності; Кf - коефіцієнт функціональної цитотоксичності. При цьому, якщо відмічають значення коефіцієнту загальної цитотоксичності більше 1,0, вважають, що досліджувана доза препарату є токсичною. У випадку, якщо значення коефіцієнту загальної цитотоксичності не перевищує 1,0, досліджувана доза препарату вважається нетоксичною. 4 Суть корисної моделі ілюструється прикладом її конкретного застосування. Спосіб реалізується у декілька етапів: готували досліджувані концентрації лікарських засобів фенсукциналу (ФС) та сполуки 2501 (похідні янтарної кислоти, розробник ДУ «ІПЕП ім. В.Я. Данилевського АМН України», м. Харків), токсичність яких випробовується. Готували клітинну суспензію синхронізованої культури одноклітинної водорості Dunaliella viridis віком 18-21 день: клітини водорості центрифугували, надосадову рідину видаляли, а осад ресуспендували в чистому середовищі Артарі до кінцевої концентрації 15млн. клітин в 1мл, в лунки планшета вносили 50мкл клітинної тестсистеми і 50мкл досліджуваної концентрації препарату. Після 30 хвилинної інкубації при кімнатній температурі проводили підрахунок відсотку клітин, що змінили морфологічні та функціональні властивості і порівнювали з контрольною культурою. Коефіцієнти морфологічної (Km) та функціональної (Кf) цитотоксичності розраховували за наведеними вище формулами. Морфологічні зміни клітин біосенсору під впливом терапевтичної дози ФС спостерігали у 14,5% клітин при контрольній величині 5%, a Km склав 0,95; під впливом 10-кратної терапевтичної дози - у 14%, відповідно Km склав 0,9; під впливом 50-кратної терапевтичної дози - у 19,5%, відповідно Km склав 1,45. Функціональні зміни клітин біосенсору під впливом терапевтичної дози ФС спостерігали у 29,5% клітин при контрольній величині 22%, aKf склав 0,75; під впливом 10-кратної терапевтичної дози - у 28,5%, відповідно Kf склав 0,65; під впливом 50-кратної терапевтичної дози - у 35,5%, відповідно Kf склав 1,35. На основі отриманих даних вирахо вували коефіцієнт загальної (сумарної) цитотоксичності. Для терапевтичної дози препарату ФС коефіцієнт загальної (сумарної) цитотоксичності (К) склав 0,85 (менше 1,0); для 10-кратної дози препарату ФС - 0,77 (менше 1,0), що також характеризує дану дозу препарату як нетоксичну; для 50кратної дози препарату ФС - 1,4 (більше 1,0), що характеризує дану доз у препарату як токсичну. Ці дані співпадають із даними гострої токсичності, які були попередньо проведені на тваринах, і згідно з якими сполуку було визначено як нетоксичну. Таким чином, використання клітинного біосенсору Dunaliella viridis для оцінки токсичності лікарських засобів у скринінгових фармакологічних та токсикологічних дослідженнях для оцінки загальної гострої токсичності є адекватним біологічним тестом. Література: 1. ATL A. Alternatives to laboratory Animals /Therd World Congress on Alternatives and Animal Use in the Life Sciences, 29 August -2 September 1999. -Bologna, Italy. -Urecht. Programm and Abstracts. -442p. 2. Toxicology in vitro. An international journal published in association with TNO BIBRA International Ltd. -Pergamon. -2001. -V5, №1. -p95-99. 5 39323 3. Доклинические исследования лекарственных средств: Метод. рекомендации /Под ред. А.В. Стефанова. -К.: Авиценна, 2002. -С.116-117. 4. Saurant M.P., Pepin D., Piccini E. Tetrahymena pyriformis: a tool for toxicological studies. A review //Chemosphere. -1999. -V.38, №7. -p16311669. 5. Богдан А. С, Заголельская Л.В. Сопоставление результатов биологического экспресанализа и санитарно-химического исследования вытяжек из полимерных материалов /Тез. Всес. конф. «Акт. вопросы токсикол., гиг. прим. пестицидов и Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко 6 полимерных материалов в н/х», Киев, 30-31 октября 1990, -К. -1990. -с.208. 6. Богдан А.С. Методы токсикологогигиенических исследований с использований с использованием в качестве тест-объекта Tetrahymena pyriformis (Мат наук.-практ. конф.«Актуальні проблеми екогігієни і токсикології», 28-29 травня 1998, К. –Ч.1 -с57-61. 7. Долгов В.А. Сравнительная оценка параметров токсичности различных веществ для инфузорий тетрохимена пириформис и белых крыс (Сб. науч. тр. ВНИИ вет. сан. ги гиены и экол. -1996. Вып.100. –с.79-84. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601