Спосіб оцінки цитотоксичної дії засобів на основі поверхнево-активних речовин

1. Спосіб оцінки цитотоксичної дії засобів на основі поверхнево-активних речовин, що включає підготовку стандартної суспензії еритроцитів, екстинкцію супернатанту водного розчину, що має задану величину, шляхом додавання фосфатного буферного розчину до суспензії крові, центрифугування та видалення супернатанту, визначення екстинкції супернатанту суспензії еритроцитів, оцінку відсотка денатурації шляхом центрифугування проб розчинів еритроцитів у воді, у буферному розчині додецилсульфату натрію, у буферному розчині засобу, визначення екстинкції їх супернатантів, обчислення коефіцієнта денатурації, оцінку гемолітичної дії засобів шляхом приготування проб розчинів засобу, центрифугування проб розчинів еритроцитів у буферних розчинах засобу різної концентрації та контрольному розчині, визначення екстинкції супернатанту проби, обчислення U 2 28727 1 3 28727 засобів на основі ПАР на клітинні мембрани та білки [див.: COLIPA validation project on in vitro eye irritation test for cosmetic ingredients and for the estimation of acute eye irritation potentials. Present status / W.J.W. Pape, U. Pfannenbecker, H. Argembeaux et all. // To xicology in Vitro. - 1999. - Vol. 13. - P.343-354]. Недоліками даного способу є необхідність використання специфічного обладнання, розрахованого на аналіз малих проб, які вимагають наступні режими центрифугування: час ценрифугування - 5сек. при 4500об/хв, об'єм проб - 1,0мл, що неможливо виконати на стандартному обладнанні, високий відсоток псевдорезультатів, які є наслідком, з одного боку, порушень дозування через утворення повітряних пробок у піпетках дозаторах при автоматизованому процесі додавання у дослідну пробірку стандартної суспензії еритроцитів, буферного розчину, води, розчинів препарату, з другого боку, через високу густину стандартної суспензії еритроцитів (концентрація суспензії еритроцитів у пробі 2,5%). Крім того, використання при оцінці гемолізу еритроцитів як позитивного контролю 0,1% розчину натрію додецилсульфату вимагає додаткових експериментальних досліджень. В основу розробки даного способу було поставлено завдання створення рішення щодо оцінки шкіро-подразнюючої дії, яке дозволить скоротити кількість тварин в експерименті, спростити процедуру виконання обраного методу, розробити критерії оцінки результатів досліджень in vitro для розділення засобів, речовин на ті, що мають потенційну шкіро-подразнюючу дію, та ті, що не подразнюють шкіру, дослідження яких на тваринах можна не проводити. Для досягнення поставленого завдання у способі оцінки цитотоксичної дії засобів на основі ПАР, який включає підготовку стандартної суспензії еритроцитів, екстинкція супернатанту водного розчину якої має задану величину, шляхом додавання фосфатного буферного розчину до суспензії крові, центрифугування та видалення супернатанту, визначення екстинкції супернатанту суспензії еритроцитів, оцінку відсотку денатурації шляхом центрифугування проб розчинів еритроцитів у воді, у буферному розчині додецилсульфату натрію, у буферному розчині засобу, визначення екстинкції їх супернатантів, обчислення коефіцієнту денатурації, оцінку гемолітичної дії засобів шляхом приготування проб розчинів засобу, центрифугування проб розчинів еритроцитів у буферних розчинах засобу різної концентрації та контрольному розчині, визначення екстинкції супернатанту проби, обчислення відсотку гемолізу еритроцитів в суспензії проби, розрахунок узагальнюючого коефіцієнту пошкоджуючої дії, згідно рішення, яке пропонується, екстинкцію супернатанту стандартної суспензії еритроцитів у водному розчині при обраній стандартній дозі встановлюють 0,925-0,950, центрифугування при підготовці стандартної суспензії еритроцитів, оцінці відсотку денатурації, оцінці гемолітичної дії засобів проводять з об'ємом проб 4,0-4,1мл при 4 концентрації суспензії еритроцитів 1,25-1,26% у пробі протягом 10-15хв. при 1500-2000об/хв; при оцінці гемолітичної дії засобів проби розчинів засобу готують із розчинів різної концентрації, як контрольний розчин використовують 1,25-1,26% розчин стандартної суспензії еритроцитів у дистильованій воді, узагальнюючий коефіцієнт пошкоджуючої дії, який є коефіцієнтом цитотоксичності (Кс), розраховують за формулою Кс=H50/D х10000, де Н50 - концентрація засобу, при якій наступає гемоліз 50% клітин у суспензії; D коефіцієнт денатурації гемоглобіну, а при значенні Кс>10 засіб вважають таким, що не спричиняє подразнення шкіри. Обрані режими центрифугування та підібрані об'єми проб, що досліджуються, змінюють процедуру виконання досліджень дозволяючи використовува ти поширене обладнання, зменшенняконцентрації клітин в стандартній суспензії еритроцитів в 2 рази зменшує її густину, що полегшує дозоване додавання її до проби, можливість використання позитивного контролю 1,25-1,26% розчину стандартної суспензії еритроцитів у дистильованій воді обумовлено тим, що за рахунок зміни осмотичних умов поживного середовища еритроцитів наступає їх 100% гемоліз, який супроводжується надходженням гемоглобіну у оточуюче середовище і реєструється по максимальному забарвленню його. Вплив різних засобів на основі ПАР на мембрану клітини та білкові структури може бути різний в залежності від біологічної дії на еукаріотичну клітину комплексу факторів: ПАР, інших компонентів рецептури, комплексів, що утворились при взаємодії компонентів рецептури між собою. Тому, використання одного показника для оцінки ірітаційного потенціалу дає неповноцінну характеристику засобу. Для урахування двох характеристик (здатності спричиняти гемоліз еритроцитів та денатурацію гемоглобіну) обраний коефіцієнт цитотоксичності (Кс), який узагальнює результати досліджень, враховуючи і гемолітичну і денатураційну здатність засобу одномоментно. Здійснення способу оцінки проводиться наступним чином: Для підготовки стандартної суспензії еритроцитів в пробірку з 0,5мл цитратного розчину (рецептура: 1,936г тринатрійцитрату, 0,924г лимонної кислоти, 100мл дистильованої води) додають свіжу кров ссавців 4мл, перемішують, центрифугують 10хв. при 2000об/мін, видаляють верхній шар сироватки з фібрином. Далі, промивають буферним розчином (рецептура: 0,395 динатрійгідрофосфат, 0,76г калійдигідрофосфат, 0,72 натрійхлорид, 0,18 Дглюкози, 100мл води дистильованої) 3 рази, додають буферний розчин в об'ємі, що дорівнюється об'єму видаленої сироватки. Для перевірки густини суспензії еритроцитів в пробірки додають 3,95мл дистильованої води, 0,05мл суспензії еритроцитів, перемішують, центрифугують, оцінюють екстинкцію супернатанту при довжині хвилі 540нм. Якщо екстинкція даної проби становить 0,925, то це 5 28727 означає, що суспензія еритроцитів встановлена необхідної густини і вона є стандартною суспензією еритроцитів, яка готова до роботи. В іншому випадку додають чи видаляють буферний розчин до суспензії еритроцитів і знов перевіряють її густину, як зазначено вище. Ці процедури проводять поки не отримають стандартну суспензію еритроцитів. При оцінці коефіцієнту денатурації визначають коефіцієнт екстинкції розчину стандартної суспензії еритроцитів у воді, у буферному розчині з додецилсульфатом натрію, у буферному розчині з засобом. Для цього в перші 9 пробірок додають 3,95мл дистильованої води, 0,05мл стандартної суспензії еритроцитів, у другі 9 пробірок - 3,75мл дистильованої води, 0,2мл % розчину додецилсульфату натрію у буферному розчині, 0,05мл стандартної еритроцитів, у треті 5 пробірок - 3,75мл дистильованої води, 0,2мл 1% розчину засобу у буферному розчині, 0,05мл стандартної суспензії еритроцитів. Вміст пробірок перемішують, струшують у міксері протягом 10хв, центрифугують 10хв при 2000об/мін., вимірюють екстинкцію супернатантів при 575 та 540нм, обчислюють коефіцієнт екстинкції (Q) для кожної групи за формулою: Q=E575/E 540 , де Е575 - значення екстинкції проби при довжині хвилі 575нм, Е540 - значення екстинкції проби при довжині хвилі 540нм, Q - коефіцієнт екстинкції продукту, що досліджується. Відсоток денатурації обчислюють за формулою: D=(Qw-QРr)/ (Qw-QNLS)·100%, де Qw - коефіцієнт екстинкції води, QPr - коефіцієнт екстинкції продукту, QNLS - коефіцієнт екстинкції додецилсульфату натрію, D - коефіцієнт денатурації гемоглобіну. Для визначення гемолітичної дії засобів готують розчини різної концентрації засобу у буферному розчині, потім, в пробірки розливають по 3,75мл буферного розчину розливають, по 0,2мл розчину засобу n-ої концентрації у буферному розчині (на розчин кожної концентрації по 3 пробірки), по 0,05мл стандартної суспензії еритроцитів, в контрольні пробірки (3шт.) розливають по 3,95мл дистильованої води та по 0,05мл стандартної суспензії еритроцитів. Вміст пробірок перемішують, стр ушують у міксері протягом 10хв, центрифугують 10хв при 2000об/мін., вимірюють екстинкцію супернатантів при 530нм, обчислюють відсоток гемолізу еритроцитів у пробі за формулою: h=EPr/EW·100%, де h - відсоток гемолізу еритроцитів у пробі, ЕРr екстинкція супернатанту дослідної проби, EW екстинкція супернатанту контрольної проби. Будують за допомогою програми Microsoft Excel криву залежності концентрації, при якій наступає гемоліз, від відсотку гемолізу еритроцитів при даній концентрації, з рівняння кривої виводять значення концентрації гемоглобіну, при якій наступає гемоліз 50% еритроцитів (Н50). Коефіцієнт цитотоксичності для даного засобу обчислюють за формулою: Кс=H50/D x10000, де 6 Н50 - концентрація засобу, при якій наступає гемоліз 50% клітин у суспензії; D - коефіцієнт денатурації гемоглобіну, Кс - коефіцієнт цитотоксичності. Були проведені порівняльні дослідження розробленим in vitro способом, що викладено вище, та традиційним способом дослідження шкіро-подразнюючої дії на лабораторних тваринах за [Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно-допустимых уровней загрязнения кожи/ Метод, указания.- М.: Минздрав СССР, 1979. №2102-79, 23с.]. Результати порівняльних досліджень in-vivo та in vitro способів представлені в табл. 1. Оцінка цитотоксичної дії засобів на основі ПАР способом in vitro та ш № 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Найменування засобу 2 Крем-мило дитяче №1 Піна для ванн для дітей №1 Шампунь для дітей №1 Піна для ванн для дітей №2 Шампунь для дітей №2 Піна для ванн для дітей №3 Гель-душ №1 Шампунь №3 Шампунь №4 Шампунь №5 Дитяче рідке мило №2 Гель для душа №2 Гель для інтимної гігієни №1 Гель для душу №3 Шампунь №6 Гель для душу №4 Шампунь для волосся та тіла для чоловіків №7 Гель для душу №4 Шампунь і кондиціонер для чоловіків №1 Шампунь проти лупи №8 Піна для ванн №4 Гель-душ-піна №5 Шампунь №9 Гель для душу №6 Шампунь проти лупи №10 Шампунь №11 Крем-мило №3 Піна для ванн №6 Крем-мило №4 Шампунь №12 Шампунь №13 Рідке мило №5 Шампунь проти лупи №14 Лікувальний шампунь проти псоріазу, себореї, лупи №15 Рідина для миття посуду №1 Примітка: *клас засобів за ступенем проявлення шкіро-подразню воздействия вредных химических соединений на кожные покровы допустимых уровней загрязнения кожи" №2102-79. 7 28727 В результаті проведених досліджень за способом in vivo встановлено, що серед досліджених засобів виявлено тільки три, які показали різний за ступенем проявлення ефект шкіро-подразнюючої дії: рідина для миття посуду №1 (різко виражену подразнюючу дію (4 клас), крем-мило №3, рідке мило №5 (сухість, лущення шкіри (0-1 клас)). Ці ж засоби при оцінці заявленим способом показали: рідина для миття посуду №1 Кс-0,76, тобто Кс