Спосіб експериментального моделювання ішемічного інсульту в басейні середньої мозкової артерії на білих щурах

Спосіб експериментального моделювання ішемічного інсульту в басейні середньої мозкової артерії на білих щурах, що включає експериментальні дослідження у галузі патофізіології та нейрофармакології церебральної ішемії, який відрізняється тим, що за допомогою комерційно виготовленого монофіламентного оклюдера із си 3 вильної інтерпретації одержаних результатів і їх екстраполяції в клінічних умовах. Відповідно до різноманітних причин, механізмів і патоморфологічних проявів ішемічного інсульту в людини, дослідниками запропонована велика кількість експериментальних моделей [6, 8, 9]. Проте жодна з існуючих на сьогодні моделей ішемічного інсульту не відтворює повною мірою тих змін, які відбуваються в тканинах головного мозку людини при ішемічному ураженні. Фізіологічна, міжвидова і популяційна варіабельність, використання різноманітних засобів і способів для моделювання судинної оклюзії, широке розмаїття методів оцінки ступеня оклюзії та подальших морфологічних змін і функціональних наслідків у тварин є чинниками, які обмежують безпосередню клінічну екстраполяцію даних [8, 9]. Стандартизація експериментальних процедур і уніфікація підходів до оцінки результатів лабораторних досліджень згідно із рекомендаціями SFES (Society for Experimental Stroke) дозволяє проводити раціональну клінічну інтерпретацію експериментальних даних [7]. Вибір лабораторних тварин має важливе значення з точки зору складності механізмів інсульту та філогенетичної близькості морфофункціональних властивостей мозку тварин до людини. Незважаючи на деякі переваги великих тварин (примати, собаки, кішки), більшість дослідників використовує для моделювання церебральної ішемії щурів і мишей [6, 9]. Анатомічна подібність церебральних судин та малі розміри головного мозку дозволяють широко застосовувати методи фізіологічного, морфологічного та біохімічного аналізу. Можливість порівняно швидкого одержання генетично однорідних ліній тварин у великій кількості є економічно доцільним і виправданим з огляду на необхідність одержання статистично достовірних даних [7]. Перевагою використання щурів є їх порівняно більша маса тіла та менші коливання фізіологічних параметрів в умовах загальної анестезії [8]. Найбільш поширені моделі, які відтворюють механізми розвитку ішемічного інсульту в людини і які можна використовувати як найближчі аналоги, можна умовно поділити на дві групи: моделі мультифокальної (емболія аутологічним тромбом, мікросферами, фотохімічна, ендотелін-індукована) та фокальної церебральної ішемії (транскраніальні та ендоваскулярні) [6, 9]. Недоліками моделей мультифокальної ішемії є висока варіабельність розмірів зони інсульту та спонтанна реканалізація (тромбоемболічна модель), менша подібність до інсульту в людини (фотохімічна модель), поганий контроль тривалості та вираженості ішемії (ендотелінова модель). Найчастіше дослідники надають перевагу моделям фокальної церебральної ішемії, яка досягається шляхом тимчасової оклюзії СМА на поверхні кори мозку (коагуляція, перев'язка або кліпування) або за допомогою ендоваскулярного введення монофіламентної нитки у просвіт внутрішньої сонної артерії (ВСА) із її подальшим просуванням у передню мозкову артерію із блокуванням просвіту СМА [6, 7]. Модель транскраніальної оклюзії СМА, вперше запропонована Tamura 67396 4 (1981), має певні недоліки, пов'язані з інвазивністю та технічною складністю оперативного втручання, а також можливістю механічного чи термічного ушкодження кори мозку [4]. Монофіламентна оклюзія СМА вперше здійснена Koizumi (1986), у різноманітних модифікаціях сьогодні використовується у багатьох лабораторіях і рекомендована SFES для проведення доклінічних випробувань лікарських речовин і генно-клітинних технологій при ішемічному інсульті [5, 6]. Дана модель є однією з найбільш близьких до патофізіологічних умов при ішемічному інсульті у людей. Фізико-механічні властивості оклюдерів, особливості хірургічної техніки та правильний вибір експериментальних тварин є ключовими чинниками, які визначають кінцевий результат моделювання - розвиток ішемічного інсульту певних розмірів і локалізації, який проявляється стійким вираженим функціональним дефектом [6,9]. При цьому коливання розмірів ділянки ішемічного ушкодження та ступеня неврологічних порушень у лабораторних тварин повинні бути мінімальними. Як оклюдери дослідниками використовуються монофіламентні нитки, на кінцях яких є потовщення, утворене за рахунок нагрівання або покриття різними адгезивними речовинами (гелі, гума, лаки, силікон) [6, 9]. Доведено, що застосування оклюдерів, покритих адгезивами, призводить до зменшення частоти ускладнень (субарахноїдальний крововилив) і підвищення надійності оклюзії [6, 7]. Комерційно виготовлені монофіламенти із силіконовим покриттям рекомендовані SFES для використання у доклінічних випробуваннях [6]. Важливим нюансом хірургічної техніки при інтралюмінальній оклюзії СМА є виключення колатерального кровоплину, що досягається коагуляцією та перев'язкою гілок зовнішньої сонної артерії (ЗоСА) та крилопіднебінної артерії (екстракраніальна гілка внутрішньої сонної артерії) за методикою Longa et al [3]. Проте дані методики не дозволяють виключити колатерального кровоплину через передню та задню сполучні артерії. Запропонована модель передбачає використання комерційно виготовлених силіконових монофіламентів для перманентної оклюзії СМА в умовах виключення колатерального кровоплину завдяки блокуванню гілок ЗоСА, крилопіднебінної гілки ВСА та перев'язки контралатеральної загальної сонної артерії (ЗСА). Задачею запропонованої корисної моделі є розробка такої моделі II, яка забезпечуватиме надійне блокування кровоплину в СМА при відсутності ускладнень та мінімальній варіабельності розмірів інсультної зони і супроводжуватиметься розвитком стійкого тривалого неврологічного дефіциту. Поставлена задача вирішується тим, що за допомогою комерційно виготовленого монофіламентного оклюдера із силіконовим покриттям здійснюється постійна ендоваскулярна оклюзія середньої мозкової артерії у щурів в умовах блокування колатерального кровоплину таким чином, що дистальний кінець оклюдера із силіконовим покриттям герметично блокує просвіт судини завдяки щільній адгезії силіконового покриття до ендотелію, забез 5 печуючи надійне виключення середньої мозкової артерії із кровоплину і створюючи умови для розвитку гострого порушення мозкового кровообігу із формуванням чітко окресленої зони ішемічного інсульту, що проявляється виникненням стійкого неврологічного дефіциту в піддослідних тварин. А саме, за допомогою ендоваскулярного введення комерційно виготовленого монофіламентного оклюдера Doccol із силіконовим покриттям у просвіт ВСА щура через куксу ЗоСА при мінімізації колатерального кровоплину шляхом виключення екстракраніальних гілок ЗоСА і ВСА, а також контралатеральної ЗСА таким чином, що оклюдер просувається у просвіт передньої мозкової артерії, тим самим блокуючи кровоплин у СМА, забезпечуючи щільну адгезію дистального кінця оклюдера, вкритого силіконом, до інтими судини умови, що створює умови для формування чітко окресленого вогнища ішемічного інсульту із розвитком стійкого вираженого неврологічного дефіциту у піддослідних тварин. Спосіб виконується наступним чином. Самці білих безпорідних щурів чистої лінії з масою тіла 280-320 г утримуються в умовах віварію протягом 12 год. вночі без їжі, проте з вільним доступом до води. Анестезія досягається інтраперитонеальним введенням каліпсолу в дозі 75 мг/кг і седазину в дозі 10 мг/кг маси тіла. Щур фіксується на операційному столику у положенні на спині. Після гоління шерсті у ділянці передньої поверхні шиї операційне поле обробляється розчинами антисептиків (бетадин, 70 % етиловий спирт) та ізолюється асептично. Шкіра та м'які тканини інфільтруються 0,5 % розчином новокаїну. Лінійний розріз шкіри довжиною до 4 см проводиться по середній лінії від під'язикової кістки до яремної вирізки грудини. Шкіра по обидва боки відсепаровується та розводиться за допомогою затискачів. Тупим шляхом єдиним блоком виділяються вилочкова та щитоподібна залози, які відводяться вгору. Ранорозширювач встановлюється між грудинноключично-соскоподібним і двочеревцевим м′язом, а лопатково-під'язиковий м'яз коагулюється і розділяється дистально. За допомогою хірургічного мікроскопа під збільшенням 12,5 виділяються ЗСА, ЗоСА і ВСА. Шляхом гострої дисекції судини звільняються від сполучної тканини та нервів. Блукаючий нерв відділяється від ЗСА та ВСА. ЗСА і ЗоСА відводяться за допомогою лігатур. У подальшому виділяється потилична гілка ЗоСА, яка коагулюється і пересікається. Наступним кроком ізолюються верхня щитоподібна та висхідна глоткова артерія, які також коагулюються та пересікаються. ЗоСА виділяється дистально і разом із кінцевими гілками (язикова та верхньощелепна артерія) коагулюється та пересікається. При подальшій дисекції ідентифікується петля язикоглоткового нерва у ділянці відходження крилопіднебінної артерії - екстракраніальної гілки ВСА. Остання перев'язується за допомогою поліамідної нитки 7/0 біля її відходження. Далі лігатура 6/0 нещільно накладається на ЗоСА біля біфуркації ЗСА. Мікросудинні кліпси накладаються на ЗСА і ВСА. ЗоСА пересікається на відстані 1-2 мм від біфуркації ЗСА. За допомогою накладеної лігатури мобілізо 67396 6 ваний проксимальний кінець ЗоСА підтягується і в його просвіт вводиться монофіламентний оклюдер 4/0 (Doccol Corp., US) довжиною 3 см із силіконовим покриттям довжиною 5-6 мм і діаметром дистального кінця 0,38 мм та позначкою на відстані 18-20 мм від дистального кінця, нанесеною за допомогою перманентного срібного маркера. Після введення дистального кінця оклюдера у ВСА, лігатура на куксі ЗоСА щільно затягується, фіксуючи монофіламент у просвіті судини. Кліпси знімаються і оклюдер вводиться інтракраніально до відчуття легкого опору, що зазвичай виникає при введенні 18-20 мм монофіламента (срібна позначка) і свідчить про його потрапляння у просвіт передньої мозкової артерії та блокування СМА. Після цього виділяється та перев'язується контралатеральна ЗСА. Кінець оклюдера відсікається і рана зашивається пошарово. Лінія швів обробляється антисептиками. Тварини поміщаються до клітки, де утримуються під обігрівачем до виходу з наркотичного сну. Неврологічний дефіцит і гістологічний аналіз проводяться на 1, 3, 7, 14, 21 і 28 добу - залежно від завдань дослідження. Порівняно із найближчим аналогом, запропонована модель має низку переваг: - надійно блокується просвіт СМА; - виключається колатеральний кровоплин через передню сполучну артерію; - виникає чітко окреслена зона ішемічного інсульту у корі головного мозку та смугастому тілі щурів; - у піддослідних тварин розвивається стійкий і тривалий (до 1 міс.) неврологічний дефіцит; - зменшується варіабельність розмірів зони ішемічного ушкодження та функціонального дефекту у піддослідних тварин; - підвищується статистична вірогідність одержаних даних. Джерела інформації: 1. Віничук С.М., Прокопів М.М. Гострий ішемічний інсульт. -К.: Наукова думка, 2006 - 280 с. 2. Acute ischemic stroke: an evidence-based approach / [edited by] David M. Greer. - John Wiley & Sons, Inc. - 2007. - 235 p. 3. Longa E.Z., Weinstein P.R., Carlson S., Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats // Stroke - 1989. - V.20. - p. 84-91. 4. Tamura A., Graham D.I., McCulloch J., Teasdale G.M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion // J. Cereb. Blood Flow Metab. - 1981. V.1. - p. 53-60. 5. Koizumi J., Yoshida Y., Nakazawa Т., Ooneda G. Experimental studies of ischemic brain edema: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area // Jpn. J. Stroke - 1986. - V.8. - p.1-8. 6. Liu S., Zhen G., Meloni B.P., Campbell K., Winn R.H. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition) // Exp. Stroke Transl. Med. - 2009. - V.2, №2. - p. 2-27. 7 67396 7. Carmichael S.T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose // NeuroRx. 2005. - V.2, №3. - p. 396-409. 8. Durukan A., Tatlisumak Т., Strbian D. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke 8 drug development // Current Pharmaceutical Design. 2008. - V.14. - p. 359-370. 9. Hossmann K.A. Experimental models for the investigation of brain ischemia // Cardiovascular Research. - 1998. - V.39. - p. 106-120. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601