Спосіб прогнозування гетерозису врожаю зерна простих гібридів кукурудзи

Спосіб прогнозування гетерозису врожаю зер на простих гібридів кукурудзи, який включає аналіз генетичних дистанцій між вихідними інбредними ЛІНІЯМИ за даними електрофоретичного розподілу ампліконів, який відрізняється тим, що здійснюють ампліфікацію ДНК з використанням ISSR-, одиничних і SSR-праймерів і за значеннями генетичних дистанцій і алельного складу мікросателітних локусів інбредних ліній ідентифікують рівень гетерозису врожаю зерна простих гібридів Корисна модель належить бютехнологи і може бути використана при визначенні гетерозису за врожаєм зерна простих гібридів кукурудзи Селекція на гетерозис потребує розподілу відомого вихідного матеріалу на групи з метою спрямованого добору батьківських пар для схрещувань Створення самозапилених ЛІНІЙ ДЛЯ потенційного використання як батьківських форм високопродуктивних гібридів, а також іспит тисяч гібридних комбінацій для виділення з них найбільш продуктивних носить емпіричний характер, що приводить до колосальних об'ємів непродуктивних тестерних схрещувань, значних затрат часу і коштів и не завжди дає бажаний результат Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є процедура прогнозування гетерозису за врожаєм зерна у простих гібридів кукурудзи за значеннями генетичних дистанцій між батьківськими ЛІНІЯМИ [Lanza L, de Souza С, Ottoboni L , V/eira V , de Souza A Genetic distance of inbred lines and prediction of maize single-cross performance using RAPD markers Theor and Applied Genetics 1997 V 94 N 8 P 1023-1030] За даними RAPD-аналізу ДНК інбредних ЛІНІЙ кукурудзи розраховано генетичні відстані з використаннями коефіцієнту схожості Джакарта та проведено кластерний аналіз для розподілу ЛІНІЙ на групи, який корелював з показниками врожаю насіння відповідних простих пбридів Дана корисна модель вибрана як прототип До недоліків даного способу слід віднести невщтворюваність результатів RAPD-аналізу завдяки невеликої довжини праймерів їх відпалювання проводять при низькій температурі, що призводить до неповної комплементації у сайтах праймування, і в результаті RAPD-профіль ДНК може бути різним при різних постановках полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) З метою усунення вказаних недоліків пропонується спосіб, заснований на прогнозуванні рівня гетерозису врожаю простих гібридів за даними генетичних дистанцій між батьківськими формами, що розраховано за результатами довільно праймованої ПЛР, та алельного складу мікросателітних локусів В основу корисної моделі поставлено задачу в способі прогнозування рівня гетерозису врожая зерна простих гібридів Поставлена задача вирішується шляхом підрахунку генетичних дистанцій між батьківськими формами за даними аналізу ампліконів, що отримано за допомогою ПЛР з одиничними праймерами, та на порівнянні алельного складу мікросателітних локусів ВІДМІННИМИ ВІД прототипу ознаками в корисній моделі, що заявляється, є - спосіб підготовки зразків до аналізу, - показник, по якому прогнозують високогетерозисні гібриди Спосіб забезпечує високу точність та можливість оцінки великої КІЛЬКОСТІ зразків, не потребує наявності коштовного обладнання Спосіб здійснюється таким чином 1 Виділення ДНК з зразків ЛІНІЙ, ЩО тестуються (паростка, зерна, листя, коріння) 1см-сегмент паростка (чи будь-якого органу рослини) чи зерно в 1,5мл-пробірці типу "епендорф" (далі епендорф) гомогенизувати скляним пестиком протягом 1-2хв та залити 0,5мл лізуючого буфера (0,02М EDTA, 0,1 М трю-НСІ рН 8,5 (25°С), 1,4М NaCI, 2,0% СТАВ) Лізат інкубувати ЗОхв при 55°С Додати рівний об'єм (0,6мл) суміші хлороформ со о> 7146 ізоаміловий спирт (24 1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії Отриману суміш центрифугувати 5хв при 14000об/хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чистий епендорф До водної фази додати 0,5 обсягу (0,3мл) ізопропілового спирту, перемішати і осадити ДНК центрифугуванням при 14 ОООоб /хв протягом 1хв на мікрофузі "Eppendorf 5415" Надосадну рідину злити, осад промити ДВІЧІ 0,5МЛ 70% етанола - центрифугувати при 14 ОООоб/хв протягом 1хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", надосадну рідину злити Підсушити осад при кімнатній температурі 15-20хв і розчинити в 400мкл ТЕ-буферу (0,01 М трю-НСІ, 0,001 М EDTA) 2 Флюориметричне визначення концентрації ДНК Концентрацію виділеної ДНК визначити на флюориметрі "ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer" ("Hoefer Scientific Instruments", США) у TNE-буфері (0,01 M трю-НСІ, 0,2М NaCI, 0,001 М EDTA) у присутності флюоресцентного барвника Hoechst 33258 (1мг/мл) 3 Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ПЛР проводити у 0,5мкл-епендорфах з використанням ампліфікатора "Терцик" ("ДНКтехнолопя", Росія) Реакційна суміш для проведення ПЛР об'ємом 20мкл містить 0,05М КСІ, 0,02М трю-НСІ рН 8,4 (25°С), 0,015М MgCl2, 0,01% твін-20, по 0,2тМ кожного dATP, dCTP, dTTP, dGTP, 0,25mkM прямого (А) і зворотного (В), ISSRчи одиничного праймерів, 20нг ДНК і 1 од ДНКполімерази Taq Поверх реакційного розчину нашаровувати 50мкл мінеральної олії Температурний режим ампліфікації такий 94°С 1хв, 57°С 1хв, 72°С 2хв, начальна денатурація - 5хв, фінальна елонгація - Юхв КІЛЬКІСТЬ ЦИКЛІВ - 35 ПОСЛІДОВНО СТІ праймерів наведено у таблиці 1 4 Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації Продукти ПЛР-ампліфікаци мікросателітних локусів (5мкл-аліквоту ПЛР-суміші) фракціонувати в 10% денатуруючих (8М сечовина) поліакриламідних гелях в 1 х ТВЕ-буфері (0.089М трю-НСІ, 0.089М борна кислота, 0.002М EDTA) при ПОСТІЙНІЙ напрузі 500В та температурі 60°С 1-2год залежно від довжини фрагментів ампліфікації Для приготування одного гелю розміром 16 х 18см товщиною 1мм необхідно змішати 12,5мл 8М сечовини, 12,5мл розчину 30% поліакриламіду з 8М сечовиной, 2,5мл 10 х ТВЕ-буферу, 25мкл ТЕМЕД, 50мкл 10% ПСА Гель залити у форми, як описано в керівництві користувача устаткування Перед нанесенням продуктів ампліфікації провести префорез на протязі ЗОхв при ПОСТІЙНІЙ напрузі 300В і температурі 60°С Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з 1мкл денатуруючого буфера для нанесення (98% формамщ, 0,01 М EDTA рН 8,0, 0,2% (w/v) бромфеноловий синій, 0,2% (w/v) ксиленціанол) та денатурувати протягом Зхв при 95 °С, після чого швидко охолодити на льодяній бані та за допомогою гамильтонівського шприця нанести в лунку гелю Електрофорез припинити згідно з довжиною пробігу ксиленціанолу, який відповідає розміру фрагментів ампліфікації Дві крайні доріжки гелю повинні містити зразок ДНК з відомою молекулярною вагою Як стандарт молекулярної маси використовувати ДНК фага лямбда, рестриктовану EcoRI, ДНК pUC19, рестриктовану Mspl, чи ДНК pUC18, рестриктовану Taql Таблиця 1 Характеристики використаних праймерів Тип праймеру Назва праймеру (код) phiO56 (A) phiO64 (В) phiO9O (C) phiO83 (D) псОЗО (Е) SSR phiO47 (F) phiO76 (G) phiO72 (H) phi113(l) phi008 (J) phiO31 (K) ph129(L) 1 ПОСЛІДОВНІСТЬ (б'^-З ) acg ссе aga tct gtt cct tct с atg gcg gca ggc cga ttg tt ccg aat tga aat age tgc gag aac ct аса atg aac ggt ggt tat caa cac gc eta cct ate caa gcg atg ggg a cgt gca aat aat tec ccg tgg да caa аса tea gee aga gac aag gac att cat cga cgc gtc аса gtc tac t ccc ctt tgt ctt tct tec tec cga tta gat tgg ggt gcg gga gat get cgc act gtt etc etc cac cct ctt tga cat ggt atg ttc ttc cgc ggc ttc aat ttg ace gca tea gga ccc gca gag to ace gtg cat gat taa ttt etc сад cctt gac age gcg caa atg gat tga act get cca ggt egg aga tgt да cac aac аса tec agt gac сад agt egg eta egg agg egg tg gat ggg ccc аса cat сад tc gca аса ggt tac atg age tga cga cca gcg tgc tct tec agt agt t gtc gee ata caa gca gaa gtc ca tec agg atg ggt gtc tea taa aac tc Тип праймеру Назва праймеру ISSR 11 І2 ІЗ 14 15 16 17 18 19 ПО 01 О2 ОЗ О4 О5 06 О7 О8 О9 О10 ОДИНИЧНИЙ ПОСЛІДОВНІСТЬ (5'-*3') (ас)9д (ад)9С (адс)6д (gt)9c (gct)6a (gtgba (да)9с (са)юс gt(cac)7 (ct)9g ссе аса aag aaa gca atg g ggt aag aaa ttg cac ttc с tag cct att ggg cca ccc tct tgg egg tgg gag cct agg tgg gaa gtc etc gtg ttg ca gag ccg tgc tgc egg age gee gtg aag cct gat gec ggg tgg cgt ggg gtg ggc age aac atg gca ttc ggt acg aac atg gag gta ct 7146 Продовження таблиці 1 Тип праймеру Назва праймеру (код) phiO91 (M) phiO49(N) phi115(O) рпіОбО (Р) phiO61 (Q) phiO42 (R) phiO52 (S) phiO41 (T) ПОСЛІДОВНІСТЬ (5'-»3) Тип праймеру Назва праймеру ПОСЛІДОВНІСТЬ (5'-»3') ate ttg ctt cca taa gat gca ctg ctct etc age ttc ggt tec tac аса gt gtt tgg cca tac cgt act get tct tec agt tct tec gaa acg aaa ggg eta gtg ggc gaa caa ctg gta ag aaa gag ace gtg tea gga ttg cc аса tgc aga age ttg gca tea agg get gag cga tea gtt cat cca g gac gta age eta get ctg cca t aaa caa gaa egg egg tgc tga ttc atg tgg cca tea ttc aat get gta gac аса gat gca ggt gca gec aga cag aat ggg acg аса agg tea tc ggg аса ctt eta gca gga tct gtt t ttg get ccc age gec gca aa gat cca gag cga ttt gac ggc a Продукти ампліфікації з одиничними та ISSRпраймерами фракціонувати в 2% «підводних» агарозних гелях Електрофорез проводити при кімнатній температурі протягом 2 год при ПОСТІЙНІЙ напрузі 100 В в 1хТВЕ-буфері в апараті для горизонтального електрофорезу Для приготування одного гелю розміром 15 х 20см необхідно розплавити Зг агарози у 150мл 1хТВЕ-буферу та залити у форми, як описано в керівництві користувача устаткування Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з 1 мкл буферу для нанесення (0,25% (w/v) бромфеноловий синій, 0,25% (w/v) ксилолцианол, 40% (w/v)) та нанести в лунку гелю Електрофорез припинити згідно з довжиною пробігу ксилолцианолу, який відповідає розміру фрагментів ампліфікації 5 Візуалізація продуктів ампліфікації Поліакриламідний гель фарбувати ВІДПОВІДНО методики гель покласти на 5хв у 10% етанол, перенести у 1% НІЧОз на Зхв Гель промити кілька разів дистильованою водою Гель витримати 20хв у 0,012М AgNCb у темряві, промити кілька разів дистильованою водою Гель інкубувати у відновлюючому розчині (0,28М Na2CO3 (безводний), 0,019% формалін), змінюючи розчин у кожному разі його потемніння, до появи забарвлення фрагментів ампліфікації Промити кілька разів бщистильованою водою, покласти в 10% оцтову кислоту на 2хв На завершення промити 2хв бщистильованою водою Гель зберігати між двома листами прозорої поліетиленової плівки Агарозний гель фарбувати бромистим етидієм гель покласти на 15хв у розчин бромистого етидія у концентрації 1мкг/мл Фотографувати гель з використанням світлофільтру ОС-12 в ультрафіолетовому СВІТЛІ (ЗООНМ) на плів ку «Мікрат-300» 6 Підрахунок генетичних дистанцій Електрофоретичні профілі ампліфікованої ДНК оцінювати візуально У випадку ампліфікації з ISSR- та одиничними праймерами амплікони кодувати бінарно наявність/відсутність смуги позначати «1»/«0» ВІДПОВІДНО У випадку SSR-ампліфікаци алелі кодувати " 1 " , "2", "п" від низькомолекулярного Встанов лення значень генетичних дистанцій на основі даних електрофоретичного розподілу продуктів ампліфікації з використанням коефіцієнту схожості Джакарта здійснювати за допомогою комп'ютерної програми «TREE 4 5» (або м аналогів, наприклад, "TREEVEW", "PAUP") 7 Опрацювання результатів Якщо значення генетичних дистанцій між інбредними ЛІНІЯМИ, що розраховано за даними ПЛР-аналізу з використанням ISSR-1 одиничних праймерів, є менш 0,200, то схрещення таких ЛІНІЙ не проводять Якщо алельний склад мікросателітних локусів інбредної лінії буде наступний A1B1C1I4K2P1Q1S2 (літерна частина означає код мікросателітного локусу (наведено у табл 1), цифрова - алель, що отримано за даним локусом для даного генотипу), для даної лінії характерна низька комбінаційна здатність Якщо алельний склад мікросателітних локусів інбредної лінії буде наступний A3B4C3D1E1I2K2M2Q2T2, для даної лінії характерна висока комбінаційна здатність Алельний склад за рештою локусів може бути любий Приклади конкретного використання запропонованого способу Приклад 1 Здійснювали прогнозування гетерозису за врожаєм зерна простих гібридів кукурудзи, на основі генетичних дистанцій між 15 вихідними інбредними ЛІНІЯМИ (Од7, Од17, Од18, Од24, Од139, Од141, Дк2/165, Oh43, X5753, R221, PLS61, W401, Eke 15, ВАМ97, Ok 109), розрахованими за даними електрофоретичного розподілу продуктів ампліфікації з ISSR- і одиничними праймерами Згідно значенням генетичних дистанцій (D) ліни розділили на чотири групи І - D