Спосіб встановлення рівня гібридності у простих (міжлінійних) гібридів кукурудзи

Винахід належить до біотехнології і може бути використаний при визначенні гібридності насіння кукурудзи. Використання високоякісного насіння районованих гібридів забезпечує високий врожай зерна та зеленої маси кукурудзи. Для оцінки якості гібридного насіння необхідно встановити відсоток гібридності насіння в рік їх отримання на ділянках гібридизації (за 2-3 тижня до збирання врожаю) і своєчасно прийняти рішення про подальше їх використання. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є метод визначення рівня гібридності за електрофоретичними спектрами зеїну (Контроль генетической чистоты гибридов кукурузы методом электрофоретического анализа зеїна (рекомендации). Москва. 1991. 38с.). Зеїн виділяють з окремих зернівок, проводять електрофорез зеїну в поліакріламідному гелі та аналізують компонентний склад зеїну. Шляхом порівняння отриманих спектрів материнської і батьківської форм з електрофореграмами зеїну окремих зернівок F2 встановлюють гібридність тестуємих зразків. Даний винахід вибрано як прототип. До недоліків даного способу слід віднести низький рівень поліморфізму зеїну та неможливість встановлення гібридності при ідентичності спектрів батьківських форм. З метою усунення вказаних недоліків пропонується спосіб, оснований на порівнянні електрофоретичних спектрів ДНК, отриманих в результаті ампліфікації локусів, що містять гіперваріабельні мікросателітні ділянки, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. В основу винаходу поставлено задачу встановлення рівня гібридності у простих (міжлінійних) гібридів кукурудзи шляхом типування ДНК, що дозволить підвищити надійність тестування партій насіння. Поставлена задача вирішується тим, що дослідження проводять методом ампліфікації ДНК тестуємих зразків насіння за допомогою метода полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), електрофорезу ампліфікованих фрагментів ДНК в поліакріламідному гелі та порівняння генотипів зразків між собою. Відмінними від прототипу ознаками у винаході, що заявляється, є: - спосіб підготовки зразків до аналізу; - показник, по якому ідентифікують однорідні генотипи. Спосіб забезпечує високу точність та можливість оцінки великої кількості зразків, не потребує наявності коштовного обладнання. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Виділення ДНК з 20 індивідуальних зразків простого гібриду, що тестується (паростка, зерна, листя, коріння). 1см-сегмент паростка (чи будь-якого органу рослини) чи зерно в 1,5мл-пробірці типу "епендорф" (далі епендорф) гомогенизувати скляним пестиком та залити 0,5 мл лізуючого буфера (20,0mM Na3EDTA, 0,1М ТрісНСІ рН8,5 при 25°С, 1,4М NaCl, 2,0% СТАВ) до повної мацерації тканин. Лізат інкубувати 30хв при 55°С. Додати рівний об'єм (0,6 мл) суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Отриману суміш центрифугувати 5хв при 14000об./хв на мікрофузі "Eppendorf5415", водну фазу перенести в чистий епендорф. До водної фази додати 0,5 обсягу (0,3мл) ізопропілового спирту, перемішати і осадити ДНК центрифугуванням при 14000об./хв протягом 1хв на мікрофузі "Eppendorf5415". Надосадну рідину злити, осад промити двічі 0,5мл 70% етанола - центрифугувати при 14000об./хв протягом 1хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", надосадну рідину злити. Підсушити осад при кімнатній температурі 15-20хв і розчинити в 400мкл ТЕ-буферу (10,0mM Тріс-НСl, 1,0mM ЕДТА). 2. Флюорометричне визначення концентрації ДНК. Концентрацію виділеної ДНК визначити на флюориметрі "ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer" ("Hoefer Scientific Instruments", США) у TNE-буфері (3,0M NaCl, 50,0mM Na2HPО4) у присутності флюоресцентного барвника Hoechst 33258. 3. Проведення полімєразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводити у 0,5мкл-епендорфах з використанням ампліфікатора "Терцик" ("ДНК-технологія", Росія). Реакційна суміш для проведення ПЛР об'ємом 20мкл містить: 50,0mM КСl, 20,0mM Тріс-НСl рН8,4 (25°С), 1,5mM MgCl2, 0,01% Твін-20, по 0,2mM кожного dATP, dCTP, dTTP, dGTP, no 0,25mkM прямого і зворотного праймерів, 20нг ДНК і 1од. ДНК-полімерази Taq. Поверх реакційного розчину нашаровувати 50мкл мінеральної олії. Температурний режим ампліфікації такий: 94°С 1хв; 60°С 1хв; 72°С 2хв, начальна денатурація - 5хв, фінальна елонгація - 10хв. Кількість циклів - 35. Аналізувати 10 мікросателітних локусів, розташованих на десятьох різних хромосомах. В таблиці наведено хромосомну локалізацію та послідовність фланкуючих праймерів даних SSR-локусів. Таблиця Характеристики SSR-локусів, що досліджуються Хромосомна локалізація MZE ADH2N 4S027 phi064 1,11 phi127-2 2,07 phi083 5,06 phi015 8,08 phi061 9,03 phi079 4,04 phi116 7,06 phi070 6,06 phi113 5,02 № SSR-локус 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Послідовність фланкуючих праймерів (5'- 3') TGCGAAGAAGCAGTAGCAAATGGAGGTAGAAGACGCACG CCGAATTGAAATAGCTGCGAGAACCTACAATGAACGGTGGTTATCAACACGC ATATGCATTGCCTGGAACTGGAAGGAAATTCAAACACGCCTCCCGAGTGT CGAGACCACCATCATCTGGAAGTTTGCAATCGCTTCGGGGACC GCAACGTACCGTACCTTTCCGAACGCTGCATTCAATTACCGGGAG GACGTAAGCCTAGCTCTGCCATAAACAAGAACGGCGGTGCTGATTC TGGTGCTCGTTGCCAAATCTACGAGCAGTGGTGGTTTCGAACAGACAA GCATACGGCCATGGATGGGATCCCTGCCGGGGACTCCTG GCTGAGCGATCAGTTCATCCAGCCATGGCAGGGTCTCTCAAG GCTCCAGGTCGGAGATGTGACACAACACATCCAGTGACCAGAGT 4. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Продукти ПЛР-ампліфікації (5 мкл-аліквоту ПЛРсуміші) фракціонувати в 10% денатуруючому (8М сечовина) поліакриламідному гелі в 1х ТВЕ-буфері (89,0mM тріс, 89,0mM борна кислота, 2,0mM EDTA) при постійній напрузі 500В та температурі 60°С 1-2год залежно від довжини фрагментів ампліфікації. Для приготування одного гелю розміром 16´18см товщиною 1мм змішати 12,5мл 8,0М сечовини, 12,5мл розчину 30% поліакриламіду з 8,0М сечовиною, 2,5мл 10 х ТВЕ-буферу, 25мкл ТМЕД, 50мкл 10% ПСА. Гель залити у форми, як описано в керівництві користувача устаткування. Перед нанесенням продуктів ампліфікації провести префорез на протязі 30 хв при постійній напрузі 300 В і температурі 60°С. Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з 1 мкл денатуруючого буфера для нанесення (98,0% формамід, 10,0mM ЕДТА рН8,0, 0,2% (w/v) бромфеноловий синій, 0,2% (w/v) ксиленціанол) та денатурувати протягом 3хв при 95°С, після чого швидко охолодити на льодяній бані та за допомогою гамильтонівського шприця нанести в лунку гелю. Електрофорез припинити згідно з довжиною пробігу ксиленціанолу, який відповідає розміру фрагментів ампліфікації. Дві крайні доріжки гелю повинні містити зразок ДНК з відомою молекулярною вагою. Як стандарт молекулярної маси використовувати ДНК фага лямбда, рестриктовану EcoRI, ДНК pUC19, рестриктовану MspІ, чи ДНК pUC18, рестриктовану TaqІ. 5. Візуалізація продуктів ампліфікації. Поліакриламідний гель покласти на 5хв у 10% етанол, перенести у 1% НNО3 на 3хв. Гель промити кілька разів бідистильованою водою. Витримати 20хв у 0,012М AgNO3 у темряві, промити кілька разів бідистильованою водою. Інкубувати гель у відновлюючому розчині (0,28М Nа2СО3 (безводний), 0,019% формалін), змінюючи рочин у кожному разі його потемніння, до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Промити кілька разів бідистильованою водою, покласти в 10% оцтову кислоту на 2хв, промити 2хв бідистильованою водою. Гель зберігати між двома листами прозорої поліетиленової плівки. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Здійснювали встановлення гібридності простого гібриду РозаМ, отриманого від схрещування Р346м х ГК26зм. ДНК виділяли з 20 індивідуальних 7-добових етиольованих паростків гібриду та батьківських форм. Проводили ПЛР-аналіз десятьох мікросателітних локусів. Дані порівняльного аналізу електрофоретичних спектрів ДНК наведено у таблиці. Таблиця Розподіл алелів за даними ПЛР-аналізу ДНК гібрида РозаМ та відповідних батьківських форм Гібрид РозаМ Р346м ГК26зм Гетеро- (12) та гомозиготні (11, 22) генотипі за SSR-локусами MZEADH2N phi064 phi127-2 phi083 phi015 phi061 phi079 phi116 phi070 11 12 12 12 11 12 12 12 12 11 11 11 22 11 22 11 22 11 11 22 22 11 11 11 22 11 22 phi113 12 11 22 Згідно алельному розподілу ДНК-спектр гібрида РозаМ результує компоненти ДНК-спектрів батьківських форм за десятьма локусами. Генотип гібриду РозаМ гетерозиготний за восьма локусами и гомозиготний за локусами MZEADH2N, phi015. Насіння дійсно є гібридним. Приклад 2. Здійснювали встановлення гібридності простого гібриду Сірень, отриманого від схрещування Р346м х ІК205-2зм. ДНК виділяли з 20 індивідуальних зерен гібриду та батьківських форм. Проводили ПЛР-аналіз десятьох мікросателітних локусів. Дані порівняльного аналізу електрофоретичних спектрів ДНК наведено у таблиці. Таблиця Розподіл алелів за даними ПЛР-аналізу ДНК гібрида РозаМ та відповідних батьківських форм Гібрид Сірень Р346м ГК26зм Гетеро- (12) та гомозиготні (11, 22) генотипі за SSR-локусами MZEADH2N phi064 phi127-2 phi083 phi015 phi061 phi079 phi116 phi070 12 12 11 12 12 12 11 12 12 11 11 11 22 11 22 11 22 11 22 22 11 11 22 11 11 11 22 phi113 11 11 11 Згідно алельному розподілу ДНК-спектр гібрида Сірень результує компоненти ДНК-спектрів батьківських форм за десятьма локусами. Генотип гібриду РозаМ гетерозиготний за сьома локусами и гомозиготний за локусами phi127-2, phi079, phi113. Насіння дійсно є гібридним.