Спосіб визначення оптимального режиму кріогенної обробки біотрансплантатів

Спосіб визначення оптимального режиму кріогенної обробки біотрансплантатів, який включає етап їх пробного заморожування при різних температурах з наступним висушуванням і оцінкою результату за критерієм досягнення максимально Корисна модель стосується біології, зокрема біомедичної технології, і може бути використана у виробництві консервованих біотрансплантатів, одним з технологічних етапів якого є кріогенна обробка біосубстрату як сировинного матеріалу. Відомий спосіб визначення оптимального режиму кріогенної обробки біотрансплантатів, який включає етап їх пробного заморожування при різних температурах з наступним висушуванням і оцінкою результату за критерієм досягнення максимально щадного впливу на живу тест-систему [1]. За відомим способом, кріоконсервовані при різних значеннях температури клапті тканини біотрансплантату випробовують на токсичність по відношенню до живих тестових сперматозоїдів бика у мікропрепараті шляхом визначення відсотку живих вітально забарвлених клітин. Недоліком відомого способу є недостатній рівень інформативності, точності та методичності, що випливає з інтегрального характеру тестового дослідження, в якому за рівнем токсичного впливу на реакцію цілої клітини, зокрема сперматозоїду, можна отримати інформацію загального характеру, не визначаючи при цьому реакцію на біотрансплантат з боку макромолекулярних регуляторних чинників, наприклад, ферментів та їх інгібіторів, що є необхідною умовою для проведення високоінформативного і точного технологічного дослідження з системних позицій. щадного впливу на живу тест-систему, який відрізняється тим, що заморожування проб біотрансплантатів здійснюють окремо при - 20°С, 40°С і - 196°С, а висновок про досягнення оптимального технологічного режиму роблять за показником максимальної резистентності мембран тестових клітин, зокрема ізольованих еритроцитів, до дії стандартного гемолітика після попередньої інкубації клітинної суспензії з клаптиком пробного біотрансплантату, причому як стандартний гемолітик застосовують розчин 210" 3 М соляної кислоти на ізотонічному розчині натрію хлориду. В основу корисної моделі поставлене завдання вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом застосування для кріогенної обробки декількох усталених температурних режимів, кожний з яких забезпечує принципово різні біофізичні зміни в підданій низькотемпературному впливу тканині, а також використання для реєстрації результатів зазначеного впливу високоточної методики цитологічного аналізу досягають підвищення методичності, точності та інформативності технологічного дослідження. При вирішенні поставленого завдання було взято до уваги те, що традиційно кріоконсервуванням біологічного субстрату ізольованих тканин досягають пригнічення в них біохімічних реакцій, а отже - обмінних процесів, майже повного зниження окисно-відновного потенціалу. Саме це є вирішальним у технології збереження біологічних властивостей консервованого біотрансплантату як кінцевого продукту. Проте досвід застосування консервованих біотрансплантатів показав, що біологічні властивості останніх широко варіюють залежно від характеру попередньої кріогенної обробки. Так, токсичність готового продукту, наприклад, консервованого ксенодермотрансплантату, щодо ізольованих тестових сперматозоїдів була меншою при консервуванні сировинного біосубстрату у парі рідкого азоту при (-120)°С, ніж при заморожуванні у камері рефрижератора при (-40)°С [2]. СО cv 7217 Беручи до уваги те, що однією з основних умов функціонування бюсистеми з ВІДПОВІДНИМИ біоенергетичними процесами є перенесення електронів по видовженому ланцюгу біологічних макромолекул, феномен збереження у крюконсервованому бютрансплантаті життєво важливих біологічних властивостей логічно розглядати з позицій сучасних уявлень про електронно-ядерне тунелювання [3] Здатність до окисновщновних реакцій у консервованій (при низькій температурі, у тому числі при - 196°С) біологічній тканині на найнижчому дозволеному дискретному рівні коливальної енергії макромолекул - саме це складає сутність тунелізаци як фундаментального явища матеріального світу Очевидно, завдяки електронно-ядерним тунельним переходам при низькій температурі у консервованій тканині відбуваються певні зміни в активності протеолітичних ферментів і їх інгібіторів — антиферментів у вигляді зміщення їх температурних оптимумів, що можна розглядати як технологічно важливий крок у вирішенні завдання отримання бютрансплантату з наперед заданими властивостями Цілком очевидною таким чином стає необхідність попереднього визначення оптимального технологічного режиму крюконсервування вихідного субстрату для отримання готового продукту -бютрансплантату з заданими властивостями Виходячи з наведеного, поставлене завдання вирішують тим, що у відомому способі визначення оптимального режиму кріогенної обробки бютрансплантатів, який включає етап їх пробного заморожування при різних температурах з наступним висушуванням і оцінкою результату за критерієм досягнення максимально щадного впливу на живу тест-систему, ВІДПОВІДНО до корисної моделі заморожування проб бютрансплантатів здійснюють окремо при -20°С, -40°С і -196°С, а висновок про досягнення оптимального технологічного режиму роблять за показником максимальної резистентності мембран тестових клітин, зокрема ізольованих еритроцитів, до ди стандартного гемолітика після попередньої інкубації клітинної суспензії з клаптиком пробного бютрансплантату, причому як стандартний гемолітик застосовують розчин 2 10 3 М соляної кислоти на ізотонічному розчині натрію хлориду Спосіб здійснюють таким чином Відбирають три проби бютрансплантату, наприклад, у вигляді клаптів свіжої, щойно взятої шкіри свині, промивають їх спочатку у проточній, а потім у дистильованій воді, після чого кожний з клаптів окремо вкладають у поліетиленові конверти і поміщають на 24 години ВІДПОВІДНО у середовище з температурою -20°С, -40°С і -196°С для проведення етапу крюконсервування Після його завершення три взірці крюконсервованого бютрансплантату у вигляді клаптів ксеногенної шкіри висушують ліофільним способом у вакуумній камері при 1 0 3 атм Стандартизовані за масою проби сухого бютрансплантату, наприклад, 20-30 мг, вносять у три пробірки з 2,2 мл стандартизованої за рівнем екстинкції суспензії еритроцитів в ізотонічному розчині натрію хлориду, залишаючи кожну на 15 хв Клаптики кожної з проб виймають із пробірки, а по 2 мл суспензії вносять у фотометричну кювету і 2 мл 2-10 3 М розчину соляної кислоти на ізотонічному розчині і відразу реєструють реакцію кислотного гемолізу [4] На основі отриманих результатів вираховують показник максимальної резистентності мембран суспендованих еритроцитів до дії стандартного гемолітика у кожній з трьох проб, за величиною якого роблять висновок щодо вибору необхідного режиму крюконсервування бютрансплантату Приклад 1 Із щойно взятої шкіри свині відібрали три проби бютрансплантату, зокрема, у вигляді трьох клаптів, які промили спочатку у проточній, а потім у дистильованій воді Кожний з клаптів вклали у ВІДПОВІДНО маркований поліетиленовий конверт і помістили на 24 години у середовище з температурою - 20°С, -40°С і -196°С ВІДПОВІДНО для проведення етапу крюконсервування Після його завершення три взірці крюконсервованого бютрансплантату у вигляді клаптів ксеногенної шкіри висушили ліофільним способом у вакуумній камері при 1 0 3 атм Від КОЖНОГО З отриманих клаптиків крюконсервованої і висушеної ксеногенної шкіри відібрали проби по 20 мг і внесли окремо у три пробірки з 2,2 мл стандартизованої за рівнем екстинкції суспензії еритроцитів ( 0,70 при зеленому світлофільтрі) в ізотонічному розчині натрію хлориду з експозицією 15 хв Після ЦЬОГО ДО 2 мл суспензії еритроцитів у фотометричній кюветі окремо 3 кожної пробірки вносили 2 мл 2-Ю 3 М розчину соляної кислоти на ізотонічному розчині і за допомогою самопишучого мілівольтметра реєстрували реакцію кислотного гемолізу (РКГ) На основі отриманих результатів РКГ кожної з взятих проб вирахували показник максимальної резистентності мембран суспендованих еритроцитів, користуючись для цього формулою I R _ J(E 2 -Ej) (Е3 -Е 2 ) (Е4 -Е 3 ) (Е„ - Е ^ О) де (Е2-Еі), (Е3-Е2), (Еп-Еп і) - ряд послідовних різниць екстинкцій зависі еритроцитів в кюветі за кожну хвилину РКГ у відсотках за умови Еп-Еі=100%, п число похвилинних кроків реєстрації РКГ, IRm - показник резистентності еритроцитів, % Отримані результати занесли до робочої таблиці (табл 1) За величиною IRm сформулювали висновок щодо вибору необхідного режиму крюконсервування бютрансплантату Так, при рівні резистентності еритроцитів в контрольній пробі 58,7 %, інкубація останніх з клаптиками крюконсервованої шкіри при відносно недостатньому заморожуванні, а саме -20°С і -40°С, супроводжувалося помітним зниженням резистентності еритроцитів у суспензії всього 47,2 і 48,3 відсотка ВІДПОВІДНО Навпаки, за умов попередньої обробки бюсубстрату -клаптика ксеношкіри при 196°С інкубація останнього з суспензією еритроцитів забезпечила суттєве підвищення їх резистентності, а саме 87,1 % 3 наведених в табл 1 результатів зроблено висновок про те, що при потребі виготовлення бютрансплантату з мембранопроте 7217 кторною властивістю оптимальною слід визнати обробку бюсубстрату - сировини при 196°С Приклад 2 Запропонованим способом провели крюобробку як технологічного етапу виготовлення бютрансплантатів з різних тканин, зокрема, селезінки і шкіри (табл 2) Кріогенну обробку названих тканин здійснювали при різних температурах, а саме при - 20, - 40 і - 196 °С з наступним висушуванням і оцінкою результату за критерієм досягнення максимального рівня мембранопротекторного ефекту щодо ізольованої стандартизованої суспензії еритроцитів в тестовій реакції кислотного гемолізу З наведених у таблиці 2 даних видно, що ефективність крюобробки на етапі виготовлення бютрансплантатів визначається рівнем температури заморожування субстрату, причому для кожної тканини характерні свої певні особливості, що, очевидно, визначається притаманним їм ферментантиферментним співвідношенням Так, якщо для шкірного субстрату найбільш ефективною є обробка при - 196 °С, то для субстрату із тканини селезінки ефективною слід визнати обробку не тільки при -196, але й при - 40 °С Очевидно, оп тимальний режим крюобробки тканинного субстрату слід визначати у кожному конкретному випадку, для чого й пропонується вказаний спосіб Отже, запропонований спосіб забезпечує вищий, ніж за способом-прототипом, рівень методичності дослідження, точності та інформативності його результатів, і зможе знайти використання при виборі оптимального технологічного режиму крюконсервування біологічних трансплантатів та інших біопрепаратів Джерела інформації, які слід взяти до уваги 1 Пат 10737 А, Україна Спосіб виготовлення ксенотрансплантатів/ Бігуняк В В , Лучанко П І 2 А с № 1476382 (СССР) Способ определения токсичности сыворотки крови/ Бигуняк В В , Бех Н Д , Романюк А Н , Мурованый И В З В И Гольданский, А М Каплан Туннелирование в химии и биологии / Наука и человечество Международный ежегодник М Знание, 1988 - С 129-143 4 Методи дослідження ендогенної інтоксикації організму (методичні рекомендаци'УАндрейчин М А , Бех М Д , Дем'яненко В В та ш Київ, 1998 32с Таблиця 1 Різниця екстинкцій суспензії еритроцитів в РКГ при режимах кріогенної обробки сировинного субстрату з похвилинним кроком п Три рівні крюконсервування 1 Е2-Е! -20°С 6 -40°С 6 -196°С 5 Контрольна РКГ (без 5 інкубації бютрансплантантів суспензією еритроцитів 2 Е 3 -Е 2 9 8 6 10 3 Е 4 -Е 3 15 10 8 17 Число похвилинних кроків, п 4 5 6 7 Е 7 -Е 6 Е 5 -Е 4 Ее-Е5 Е 8 -Е 7 19 27 7 12 15 24 17 13 11 16 22 15 33 15 11 6 8 Ед-Ею 5 7 11 3 9 IRm ЕЦ-Е-ІО 47,2 48,3 87,1 58,7 6 Таблиця 2 Рівень мембранопротекторного ефекту крюконсервованого біотрансплантату щодо мембран ізольованих еритроцитів при дії кислотного чинника в реакції кислотного гемолізу (X±m, P) Сери досліджень Крюконсервована селезінка свині при -20°С Крюконсервована селезінка свині при -40°С Крюконсервована селезінка свині при -196°С Крюконсервована шкіра свині при -20°С Крюконсервована шкіра свині при -40°С Крюконсервована шкіра свині при -196°С Контрольна РКГ Комп'ютерна верстка М Клюкін п 9 10 10 12 12 12 12 Підписне Р IRm 48,5±3,6 49,3±4,1 83,2±4,9 56,8±5,3 87,1 ±6,0 89,7±5,5 48,5±3,8 >0,05 >0,05 0,05