Спосіб кріоконсервування меристем часнику

Реферат: Спосіб кріоконсервування меристем часнику, що включає культивування меристем на середовище MS з вмістом сахарози 0,3 М, інкубування у кріозахисному середовищі, поміщення у контейнери, що герметизуються, заморожування у рідкому азоті і відігрів, крім того заморожування проводять над дзеркалом рідкої фази азоту на висоті 35-50 мм протягом 10-15 хв, а відігрів здійснюють у оточуючому повітряному середовищі при кімнатній температурі. UA 79464 U (54) СПОСІБ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ МЕРИСТЕМ ЧАСНИКУ UA 79464 U UA 79464 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі кріобіології і може бути використана у різних видах біотехнології, сільському господарстві для цілей розмноження рослин, зберігання їх генетичного матеріалу та виведення нових сортів. Відомі способи кріоконсервування меристем часнику шляхом вітрифікації з використанням кріозахисних середовищ PVS2, PVS3, загальна концентрація гліцерину, етиленгліколю, диметилсульфоксиду, сахарози в яких становить не менш 60 %, та охолодження шляхом занурення матеріалу у рідкий азот у кріопробірках або на стрічках з алюмінієвої фольги з наступним його перенесенням до кріопробірок з рідким азотом [1]. Однак такі способи потребують тривалого (150-180 хв) контакту біоматеріалу з кріозахисними середовищами, що знижує його життєздатність, крім цього вони не забезпечують надійного захисту від бактеріальної, фунгіальної та вірусної контамінації, тому що передбачають безпосередній контакт з середовищем рідкого азоту. Найближчим до способу, що заявляється, є спосіб кріоконсервування меристем часнику, який полягає в тому, що меристеми поміщують на поживне середовище Murashige & Skoog (MS) з вмістом сахарози 0,3 М і культивують протягом 16 годин. Далі меристеми інкубують протягом 120 хв у кріозахисному середовищі PVS N (загальна концентрація гліцерину, етиленгліколю, сахарози в розчині становить 55 %), поміщують в поліетиленові контейнери і занурюють у рідкий азот. Відігрівають у водяній бані при температурі 40 °C, відмивають від кріопротекторів 0,3 М розчином сахарози на поживному середовищі MS [2]. Недоліком цього способу є використання високих концентрацій кріопротекторів у кріозахисному середовищі, що призводить до значного зневоднення клітин тканин меристем, спричиняючи таким чином їх ушкодження і зниження процента життєздатних меристем. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування меристем часнику, в якому би за рахунок зміни технології заморожування-відігріву забезпечувалась можливість знизити концентрацію кріопротекторів у кріозахисному середовищі і таким чином зменшити ушкодження тканин. Ця задача вирішується тим, що у способі кріоконсервування меристем часнику, який включає культивування меристем на середовищі MS з вмістом сахарози 0,3 М, інкубування у кріозахисному середовищі, поміщення в контейнери, що герметизуються, заморожування у рідкому азоті і відігрів, відповідно до корисної моделі, заморожування проводять над дзеркалом рідкої фази азоту на висоті 35-50 мм протягом 10-15 хв, а відігрів здійснюють у оточуючому повітряному середовищі при кімнатній температурі. Заявлений спосіб за рахунок оптимально підібраного температурного режиму заморожування-відігріву дозволяє знизити концентрацію кріопротекторів у кріозахисному середовищі, зменшуючи цим ушкодження тканин меристем. Життєздатність меристем після відігріву підвищується на 28-46 % у порівнянні з прототипом. Спосіб здійснюють таким чином. Меристеми після їх виділення із зубків часнику культивують 5 діб на поживному середовище MS з вмістом сахарози 0,3 М і інкубують у кріозахисному середовищі протягом 35 хв. Далі меристеми поміщують у стерильні контейнери, що герметизуються, і заморожують над дзеркалом рідкої фази азоту на висоті 35-50 мм протягом 10-15 хв, після чого контейнери занурюють у рідкий азот. Відігрівають у оточуючому повітряному середовищі при кімнатній температурі до повного відтаювання. Приклад. Зубки часнику, що знаходились у стані спокою, дезінфікували, після чого з них в стерильних умовах виділяли меристеми на стандартне поживне середовище MS з вмістом сахарози 0,08 М. Для попереднього культивування меристеми переносили зі стандартного поживного середовища на поживне середовище MS без вмісту гормонів та з концентрацією сахарози 0,3 М. Культивували при температурі +10  +12 °C впродовж 5 діб. Після цього відбирали життєздатні меристеми для подальшого кріоконсервування, які інкубували протягом 35 хв у наступних кріозахисних середовищах: розчин 0,5 М метилацетаміду (МАЦ), що містив 3,5 % поліетиленоксиду (ПЕО - 6000); розчин 0,5 М метилацетаміду (МАЦ), що містив 3,5 % полівінілпіролідону (ПВП - 2400); розчин 0,5 М 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), що містив 3,5 % поліетиленоксиду (ПЕО - 6000); розчин 0,5 М метилацетаміду (МАЦ) та 1 М 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), що містив 3,5 % поліетиленоксиду (ПЕО - 6000); розчин 0,5 М метилацетаміду (МАЦ) та 1 М 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), що містив 3,5 % полівінілпіролідону (ПВП - 2400). Далі меристеми поміщали в полімерні плівчасті контейнери типу мішка, які герметизували шляхом зварювання. Заморожування здійснювали протягом 10-15 хв над дзеркалом рідкої фази 1 UA 79464 U 5 10 15 азоту на висоті 35-50 мм, після чого контейнери занурювали у рідкий азот для довгострокового зберігання. Відігрівання матеріалу здійснювали у оточуючому повітряному середовищі з кімнатною (20±5 °C) температурою повітря до повного відтаювання матеріалу. Відмивання від кріопротекторів проводили шляхом двократної зміни поживного середовища MS з вмістом сахарози 0,08 М. Після цього меристеми переносили на стандартне середовище культивування MS з вмістом фітогормонів (кінетик - 1 мг/л, індолілоцтова кислота - 1 мг/л) і витримували у темряві протягом 24 годин. Подальше культивування меристем проводили за стандартних умов. Збереженість кріоконсервованих меристем оцінювали методом мікроскопії. Меристеми, які після розморожування набували зеленого забарвлення і виявляли позитивну динаміку росту протягом 5 днів культивування на поживному середовищі, вважали збереженими. Життєздатність визначали шляхом спостереження за розвитком збережених меристем у процесі культивування протягом 90 діб. Життєздатними вважали меристеми, тканини яких після заморожування-відігріву диференціювалися у пагони з листами і коренем. Результати збереженості і життєздатності меристем часнику наведені у таблиці. З таблиці видно, що заявлений режим заморожування-відігріву дозволяє використовувати кріозахисні середовища з низьким вмістом кріопротекторів, при цьому показники збереженості кріоконсервованих меристем на 5 добу є не нижчими, ніж у прототипі, тоді як показники життєздатності на 90-ту добу культивування є вищими на 28-46 %. Таблиця Збереженість і життєздатність меристем часнику після кріоконсервування (n≥7) Спосіб кріоконсервування Прототип: PVS N Збереженість, % 92±5 95±5 88±6 93±6 85±7 90±7 75±10 95±5 90±5 85±7 Заявлений: 0,5 М МАЦ + 3,5 % ПЕО (загальна концентрація 7 %) 0,5 М МАЦ + 3,5 % ПВП (загальна концентрація 7 %) 0,5 М 1,2-ПД + 3,5 % ПЕО (загальна концентрація 7 %) 0,5 М МАЦ + 1 M 1,2-ПД + 3,5 % ПЕО (загальна концентрація 14,5 %) 0,5 М МАЦ + 1 М 1,2-ПД + 3,5 % ПВП (загальна концентрація 14,5 %) Життєздатність, % 42±7 70±5 20 25 Джерела інформації: 1. Kim H-H., Popova E., Shin D-J., Yi J-Y., Kim C, Lee J-S. Cryobanking of Korean Allium germplasm collections: results from a 10 year experience // Cryo-Letters. - 2012. - Vol. 33. - P. 45-57. 2. Пат. України № 22540, МПК A01N3/00. - Публ. 25.04.2007 p. 3. Пат. України № 70805А, МПК A01N1/02. - публ. 15.10.2004 p. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб кріоконсервування меристем часнику, що включає культивування меристем на середовище MS з вмістом сахарози 0,3 М, інкубування у кріозахисному середовищі, поміщення у контейнери, що герметизуються, заморожування у рідкому азоті і відігрів, який відрізняється тим, що заморожування проводять над дзеркалом рідкої фази азоту на висоті 35-50 мм протягом 10-15 хв, а відігрів здійснюють у оточуючому повітряному середовищі при кімнатній температурі. 35 Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2