Спосіб кріоконсервування ембріонів людини

Спосіб кріоконсервування ембріонів людини, який включає Інкубацію в кріоконсервуючому розчині, що містить етиленгліколь і сахарозу, попередню стабілізацію температури камери заморожування, повільне охолодження до температури сидингу, ручний сидинг, подальше повільне охолодження до -30-н-40°С з подальшим зануренням у рідкий азот, підігрів на водяній бані і культивування в фосфатно-буферному середовищі, який відрізняється тим, що інкубацію ембріонів в кріоконсервуючому розчині і попередню стабілізацію температури камери заморожування проводять при 22°С, ручний сидинг здійснюють при температурі кристалізації кріоконсервуючого розчину, а в середовище культивування додають 20% сироватки кордової крові людини через 24 години після початку культивування Корисна модель належить до кріобіології і кріомедицини і може бути використана в акушерстві та гінекологи Відомий спосіб кріоконсервування ембріонів людини [1], який включає інкубацію при кімнатній температурі в кріоконсервуючому розчині, що містить 1,5мопь/л етиленгліколю, 0,1моль/л сахарози і 20% сироватки кордової крові людини, охолодження від кімнатної температури до -7°С зі швидкістю 27хв., ручний СІДІНГ при -7°С , охолодження зі швидкістю 0,37хв. до -30°С з послідуючим зануренням у рідкий азот, відігрів на водяній бані при 30°С і культивування при 37°С у фосфатнобуферному середовищі з 20% сироватки крові людини. Недоліком способу є низька виживаність ембріонів - 53% Це пов'язано з тим, що усі маніпуляції перед початком заморожування проводяться при кімнатній температурі, яка може змінюватися в залежності від зовнішньо-кліматичних умов; сироватка кордової крові людини, яка додається до кріоконсервуючого розчину, блокує ембріогенез на ранніх стадіях розвитку ембріона; ручний сідінг проводиться при температурі, нижче температури кристалізації кріоконсервуючого розчину, що може привести до передчасного кристалоутворення. Відомий спосіб кріоконсервування ембріонів людини [2], згідно з яким ембріони інкубують при кімнатній температурі в кріоконсервуючому розчині, що містить етиленгліколь (1,5моль/л) та сахарозу (0,2моль/л), і охолоджують за такою програмою: до -7°С зі швидкістю 27хв, ручний сідінг при 7°С, охолодження зі швидкістю 0,37хв до -30°С, від -30"С до -150°С - зі швидкістю 507хв, після чого занурюють у рідкий азот. Відігрівають на водяній баю при 30°С, після чого культивують при 37°С у фосфатно-буферному середовищі. Недоліком способу є низька виживаність ембріонів (75-79%), що обумовлено проведенням ручного сідінгу при температурі, нижче реальної температури кристалізації, і різніцею між температурою середовища інкубації і початковою температурою камери заморожування. Найбільш близьким до заявленого способу за своєю суттю та ефектом, що досягається, є спосіб кріоконсервування ембріонів людини [3], який полягає в слідуючому: ембріони людини інкубують при кімнатній температурі в кріоконсервуючому розчині, що містить 1,5моль/л етиленгліколю, 0,2моль/л сахарози та 20% фолікулярної рідини людини, і приміщують у камеру заморожування програмного заморожувача Температуру камери заморожування попередньо стабілізують при 20°С протягом 1хв. Заморожування здійснюють за О) о 4909 такою програмою: охолоджують від 20°С до -7°С зі швидкість 27хв., витримують при цій температурі 5хв І проводять ручний сідінг, далі охолоджують до -39°С зі швидкістю 0,37хв. і занурюють у рідкий азот. Відігрівають на водяній бані при 37°С у фосфатно-буферному середовищі, в яке додають 20% фолікулярної рідини людини Недоліком способу є те, що він не забезпечує високої виживаності ембріонів (80,6%) Зниження виживаності обумовлено слідуючим. - додавання фолікулярної рідини в кріконсервуючий розчин блокує ембріогенез; - інкубацію ембріонів в кріоконсервуючому розчині проводять при кімнатній температурі, яка змінюється в залежності від сезонних умов, що приводить до перепаду температур між розчином інкубації і камерою заморожування; - ручний сідінг проводять при температурі, нижче температури кристалізації крюконсервуючого розчину, що може привести до передчасного кристалоутворення. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити відомий спосіб кріоконсервування ембріонів людини таким чином, щоб він забезпечив підвищення виживаності ембріонів. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування ембріонів людини, який включає інкубацію в кріоконсервуючому розчині, що містить етиленгліколь і сахарозу, попередню стабілізацію температури камери заморожування, повільне охолодження до температури сідінга, подальше повільне охолодження до -30-М0°С с поспщуючим зануренням у рідкий азот, відігрів на водяній бані і культивування в фосфатно-буферному середовищі, інкубацію ембріонів в кріоконсервуючому розчині і попередню стабілізацію температури камери заморожування проводять при 22°С, ручний сідінг здійснюють при температурі кристалізації кріоконсервуючого розчину, а в середовище культивування додають 20% сироватки кордової' крові людини через 24 години після початку культивування. Інкубація ембріонів в кріоконсервуючому розчині і стабілізація камери заморожування при однієї температурі дозволяє уникнути перепаду температур при переносі ембріона з крюконсервуючого розчину в камеру заморожування Проведення рунного сідінгу при температурі кристалізації кріоконсервуючого розчину виключає можливість передчасного кристалоутворення. Комп'ютерна верстка Д Шеверун Додавання в середовище культивування 20% сироватки кордової крові людини через 24 години після початку культивування, тобто після проходження ембріоном стадії дроблення, стимулює розвиток ембріона. Таким чином заявлений спосіб дозволяє підвищити виживаність ембріонів у порівнянні з прототипом на 17-18%. Приклад здійснення способу Для кріоконсервування застосовували ембріони людини, одержані методом екстракорпорального запліднення. Ембріони приміщували в крюконсервуючий розчин, що містить 1,5моль/л етиленгліколю і 0,2моль/л сахарози у фосфатному буфері та інкубували при 22°С протягом 20хв. Після цього ембріони разом з кріоконсервуючим розчином поміщували в стерильні соломинки і переносили в камеру заморожування, попередньо охолоджену до 22°С і стабілізовану при цій температурі протягом 5хв. Заморожування ембріонів здійснювали за такою програмою, охолоджували від 22°С до -5°С (температура кристалізації кріоконсервуючого розчину) зі швидкістю 27хв., при 5°С втримували протягом Юхв, проводили ручний сідінг, після чого охолоджували до -30°С зі швидкістю 0,1-0,27хв і занурювали у рідкий азот. Відігрівали на водяній бані при 37°С і переносили в фосфатно-буферне середовище для культивування. Після проходження ембріонами стадії дроблення в середовище культивування додавали 20% сироватки кордової крові людини. Виживаність ембріонів визначали шляхом оцінки морфологічних показників і частоти дроблення in vitro Вона становила 97±2%(п=10). Джерела інформації: 1. Lassalle В., Testart G., Renard G. - P. Human embyos fetures that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. - Fertility and Sterility. -1985. Vol.44, №5 - P 645-651. 2. Helena Jericho, et al. A modified cryopreservation method increases the survival of human biopsied cleavage stage embryos - Human Reproduction 2003. - V.18, №3 - P 568-571. 3. Hee-Jun Chi, et al. Cry op reservation of human Reproduction.-2002.-V.17,№8. P.2146-2151. Підписне Тираж 37 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601