Спосіб мануального видалення хромосом із ооцитів ссавців

Спосіб мануального видалення хромосом із ооцитів ссавців, що включає витримку вивільненого із прозорої оболонки зрілого ооцита в середовищі з цитохалазином і відділення від ооцита ріжучим інструментом малої частини з локалізованими в ній хромосомами, який відрізняється тим, що перед поділом на дві частини ооцитові піпеткою надають звуженої видовженої форми так, щоб хромосоми були локалізовані у кінці видовження. UA (21) a200803396 (22) 17.03.2008 (24) 12.07.2010 (46) 12.07.2010, Бюл.№ 13, 2010 р. (72) ЛІСІН ВАДИМ ІВАНОВИЧ, КОСЕНЮК ЮРІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, СКЖИШОВСЬКА МАРІЯ МІХАЛІВНА, PL, СМОРОНГ ЗДЗІСЛАВ СТАНІСЛАВОВИЧ, PL (73) ЛІСІН ВАДИМ ІВАНОВИЧ, КОСЕНЮК ЮРІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, СКЖИШОВСЬКА МАРІЯ МІХАЛІВНА, PL, СМОРОНГ ЗДЗІСЛАВ СТАНІСЛАВОВИЧ, PL (56) Li J., Du Y., Zhang Y. H., Kragh P. M., Pump S., Bolund L., Yang H., Xue Q. Z., Vajta G. Chemically assisted handmade enucleation of porcine oocyte// Cloning and stem cells. - Vol. 8, No.4. - 2006. P.241-250. Peura T. T., Vajta G. A comparison of established and new approaches in ovine and bovine nuclear transfer// Cloning and stem cells. - Vol. 5, No.4. 2003. - P.257-277. RU 2220679 C2, 10.01.04. US 4664097, 12.05.87. Levron J., Willadsen S., Munne S.ey al. Formation of male pronuclei in partitioned human oocytes. Biology of Reproduction, 1995, V.53, P.209-213. C2 2 (19) 1 3 сті прототипу (Фіг.1) [Peura T.T., Vajta G. A comparison of established and new approaches in ovine and bovine nuclear transfer // Cloning and stem cells. - Vol. 5, No. 4. - 2003. - P. 257-277 (див. Р. 267)]. Цей спосіб включає витримку вивільненого із прозорої оболонки зрілого ооцита в середовищі з цитохалазином (див. Фіг.1(1)) і відділення від ооцита ріжучим інструментом малої частини з локалізованими в ній хромосоми (див. Фіг.1(2-3)). Однак і при такому способі, хоча й досягається можливість видалення із ооцитів хромосом з малою кількістю цитоплазми, все ж не вирішується проблема міграції і вислизання ооцита з-під ріжучого інструмента при мануальному відділенні від нього частини, в якій локалізовані хромосоми. Це затрудняє процес видалення хромосом, знижує точність відтинання місця їх локалізації і стабільність видалення з хромосомами малої кількості цитоплазми, а також підвищує ризик механічного пошкодження ооцита при виконанні цієї операції. В основу винаходу поставлено завдання удосконалити спосіб мануального видалення хромосом із ооцитів ссавців шляхом зміни форми ооцита перед процедурою видалення хромосом так, щоб зробити місце локалізації хромосом більш зручним для відтинання і щоб сам ооцит при виконанні цієї операції менше мігрував і не вислизав з-під ріжучого інструмента, що приведе до полегшення процесу видалення хромосом і дозволить точніше і з меншим ризиком механічного пошкодження ооцита видаляти із нього хромосоми із стабільно малою кількістю цитоплазми. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі мануального видалення хромосом із ооцитів ссавців, що включає витримку вивільненого із прозорої оболонки зрілого ооцита в середовищі з цитохалазином і відділення від ооцита ріжучим інструментом малої частини з локалізованими в ній хромосоми, згідно винаходу, перед поділом на дві частини ооцитові піпеткою надають звуженої видовженої форми так, щоб хромосоми були локалізовані у кінці видовження (Фіг.2). Повне чи часткове втягнення ооцита, що має зазвичай кулеподібну форму (див. Фіг.2А(1) і Фіг.2Б(1)), з боку презумптивного місця розташування хромосом, яке знаходиться в зоні, прилеглій до полярного тільця та/або до викликаного демеколцином eкструзивного випину хромосомного апарату, в порожнину піпетки з меншим, ніж у ооцита, діаметром приводить до відновлюваного звуження і видовження, відповідно, або всього ооцита (див. Фіг.2А(2)), або тільки його піпетованої частини (див. Фіг.2Б(2)), а також до локалізації хромосом ооцита у кінці цього видовження, яке зберігається у ооцита після виведення із піпетки протягом деякого часу, достатнього для виконання ріжучим інструментом маніпуляцій по відділенню від ооцита місця локалізації хромосом. Надання ооцитові чи його частині, що підлягає оперуванню, видовженої форми, у кінці якої локалізовані всі його хромосоми (див. Фіг.2А(2) і Фіг.2Б(2)), дозволяє зробити місце локалізації хромосом більш зручним для відтинання і зменшити при цьому міграцію і вислизання ооцита з-під ріжучого інструмента. За рахунок цього стає мож 91234 4 ливим підвищити точність видалення із ооцитів хромосом і стабільність видалення разом із хромосомами малої кількості цитоплазми (див. Фіг.2А(3) і Фіг.2Б(3)), а також зменшити ризик механічного пошкодження об'єктів, які оперуються. До того ж, обумовлене видовженням форми звуження ооцита в частині, що підлягає оперуванню, дозволяє послабити натяг мембрани ооцита і зменшити периметр її окрайків в площині відтинання, що сприяє кращому зімкненню окрайків мембрани при перетисненні ооцита на дві частини ріжучим інструментом, а отже і кращому перенесенню ооцитом цієї операції і кращому відновленню після цього цілісності його мембрани (див. Фіг.2А(3-4) і Фіг.2Б(3-4)). Таким чином полегшується виконання і підвищується надійність видалення із ооцитів хромосом ріжучим інструментом вручну, а також забезпечуються умови, що сприяють кращому перенесенню об'єктами цієї операції. Це робить модифікований спосіб мануального видалення хромосом із ооцитів технічно більш простим і, разом з тим, більш надійним, а також більш щадячим для об'єктів, що оперуються. Пропонований спосіб здійснюється таким чином. Дозрілі до стадії метафази II мейозу ооцити очищують від кумулюсу піпеткою в середовищі Дюльбекко, доповненому гіалуронідазою в концентрації 10-12,5 мг/мл. Очищені від кумулюсу ооцити відмивають у чистому середовищі Дюльбекко і почергово по 5-7 штук переносять у розчин Рінгера, доповнений протеолітичним ферментом проназою в концентрації 5-10 мг/мл, для перетравлення і витончення прозорої оболонки. Не дожидаючись повного перетравлення прозорої оболонки, ооцити переносять в середовище Дюльбекко з 20% сироватки крові плодів великої рогатої худоби або з 4-20 мг/мл альбуміну сироватки крові бугая для повної нейтралізації залишків пронази. Витончену проназою прозору оболонку видаляють з ооцитів піпеткою. Для точної візуалізації місця локалізації хромосом застосовують 45хвилинну інкубацію ооцитів в середовищі для дозрівання (склад якого є специфічним для ооцитів різних видів тварин), доповненому демеколцином в концентрації 0,4 мкг/мл, що приводить до екструзивного випину хромосомного апарату у вигляді маленької шишки на поверхні ооцита. Цей випин візуально-морфологічно дуже схожий на полярне тільце і в більшості випадків утворюється поруч із ним (див. Фіг.1(1), а також фіг.2А(1) і Фіг.2Б(1)). Обробка демеколцином може проводитися як перед очисткою ооцитів від кумулюсу, так і після неї або ж після видалення у ооцитів прозорої оболонки. А може і взагалі не застосовуватися. В цьому випадку презумптивне місце розташування хромосом визначають по полярному тільцю. Вивільнені із прозорої оболонки ооцити групами по 5-10 штук помішують в середовище Дюльбекко, доповнене цитохалазином в концентрації 2,5-7,5 мкг/мл, а також 20% сироватки крові плодів великої рогатої худоби або 4-20 мг/мл альбуміну сироватки крові бугая. Після витримки ооцитів протягом 5-7 хвилин в цих умовах приступають до видалення хромосом. Операцію проводять почергово з кожним оо 5 цитом групи. Для цього, згідно удосконаленого способу, акуратно всмоктують в порожнину піпетки з меншим, ніж у ооцита діаметром, або весь ооцит, або його частину точно з боку полярного тільця та/або викликаного демеколцином випину хромосомного апарату і також акуратно виводять об'єкт із піпетки. Правильне і точне виконання цієї процедури приводить до звуження і видовження, відповідно, або всього ооцита (див. Фіг.2А(2)), або тільки його піпетованої частини (див. Фіг.2Б(2)) і до локалізації полярного тільця та/або викликаного демеколцином випину хромосомного апарату у кінці цього видовження. Одразу ж після цієї маніпуляції металевим мікроножем або скляною мікроголкою відтинають від ооцита невелику частину самої кінцівки цього видовження, яка прилягає до полярного тільця та/або до викликаного демеколцином випину хромосомного апарату і є презумптивним місцем розташування хромосом ооцита (див. Фіг.2А(3) і Фіг.2Б(3)). При правильному виконанні операції ооцит після видалення хромосом протягом декількох хвилин повністю відновлює природну для нього кулеподібну форму, має чітке окреслення мембрани і незмінну, в порівнянні з початковою, консистенцію цитоплазми (див. Фіг.2А(1 і 4) і Фіг.2Б(1 і 4)). Це свідчить про повне відновлення цілісності мембрани і незмінність вмісту цитоплазми прооперованого ооцита, а отже і про його придатність до подальшого використання в реконструкції. Для визначення певності видалення із ооцитів хромосом може застосовуватися забарвлення ооцитів вітальним флуоресцентним ДНК-специфічним барвником Hoechst 33342 і подальше контролювання наявності чи відсутності хромосом у забарвлених прооперованих об'єктів за допомогою ультрафіолетової мікроскопії. Таким чином, пропонованим способом за рахунок попереднього звуження і видовження форми ооцита забезпечують умови для більш зручного і менш ушкоджуючого видалення у нього хромосом ріжучим інструментом вручну. Можливість здійснення пропонованого способу мануального видалення хромосом із ооцитів підтверджена прикладом і відеоілюстраціями поетапного перетворення об'єкта за двома модифікаціями техніки виконання цієї операції (див. Фіг.2А і Б). Приклад. Техніка проведення мікроманіпуляцій по мануальному видаленню хромосом із ооцитів за удосконаленим способом (див. Фіг.2) була відпрацьована і випробувана на 107 ооцитах кроля. Ще на 32 ооцитах кроля було проведено видалення хромосом за традиційним способом, прийнятим в якості прототипу (див. Фіг.1). Обидві групи ооцитів перед видаленням хромосом були оброблені демеколцином. Для надання ооцитам видовженої форми в досліді використовували скляні ротові піпетки з меншим, ніж у ооцита, внутрішнім діаметром, а в якості ріжучого інструменту для поділу ооцитів на частини - скляні мікроголки. 91234 6 Проведення порівняльних експериментів показало, що попереднє надання ооцитам звуженої видовженої форми (див. Фіг.2А(2) і Фіг.2Б(2)) дозволяло значно зменшувати міграцію об'єктів під час поділу на частини і добре запобігати при цьому їх вислизанню з-під ріжучого інструмента. Це, в порівнянні із традиційним способом мануального видалення хромосом, значно полегшувало виконання мікроголкою маніпуляцій по відтинанню від ооцита частини, в якій локалізовані хромосоми, і добре позначалося на перенесенні ооцитами цієї операції. Так із 107 прооперованих за удосконаленим способом ооцитів 88 (82,2%) після видалення хромосом відновили кулеподібну форму, мали чітке окреслення мембрани і незмінну, в порівнянні з початковою, консистенцію цитоплазми, тобто за візуально-морфологічною оцінкою не мали ознак травмування і були придатними до подальшого використання в реконструкції. За цим показником удосконалений спосіб видалення хромосом виявився на 13,5% кращим від традиційного, ефективність якого в нашому досліді склала 68,7% (22 неушкоджених ооцити із 32 прооперованих). До того ж слід відмітити, що при оперуванні ооцитів традиційним способом, внаслідок постійної міграції їх під ріжучим інструментом, далеко не завжди удавалося видаляти у них разом із хромосомами стабільно малу кількість цитоплазми (див. Фіг.1(2 i 3)), як це виходило при оперуванні за удосконаленим способом (див. Фіг.2А(3 і 4) і Фіг.2Б(3 і 4)). Удосконалений спосіб також було перевірено на надійність видалення хромосом із ооцитів. Застосування вітального флуоресцентного ДНКспецифічного барвника Hoechst 33342 і ультрафіолетової мікроскопії показало повну відсутність хромосом у 36 (97,3%) із 37 вибраних випадковим чином для перевірки ооцитів, які були прооперовані за удосконаленим способом. За експериментальними даними інших дослідників ефективність видалення хромосом із ооцитів традиційними способами, прийнятими в якості аналогу [Li J., Du Y., Zhang Y.H., Kragh P.M., Purup S., Bolund L., Yang H., Xue Q.Z., Vajta G. Chemically assisted handmade enucleation of porcine oocyte // Cloning and stem cells. - Vol. 8, No. 4. - 2006. - P. 241-250 (див. Р. 241)] і прототипу [Peura T.T., Lewis I.M., Trounson A.O. The effect of recipient oocyte volume on nuclear transfer in cattle // Molecular reproduction and Development. - No. 50. - 1998. - P. 185-191 (див. P. 186)], складає приблизно 90%. Приведені експериментальні дані показують, що відмінні особливості удосконаленого способу видалення хромосом із ооцитів дозволяють полегшити виконання цієї процедури ріжучим інструментом вручну, підвищити точність відтинання у ооцитів місця локалізації хромосом і надійно видаляти їх із стабільно малою кількістю цитоплазми, а також покращити перенесення об'єктами цієї операції. 7 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 91234 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601