Спосіб оцінки функціонального стану клітин біологічних об`єктів in vitro

1. Спосіб оцінки функціонального стану біологічних об'єктів in vitro, який включає зміну умов, у яких здійснюються фізіологічні функції об'єкта, де C2 2 (19) 1 3 лення ізоферментів ЛДГ після попередньої інкубації з детергентом та без нього. Недоліком відомого способу є те, що він являє собою аналіз лише окремого показника (активності ізоферментів ЛДГ) і не може дати комплексного уявлення про загальний стан та напрямок змін у клітинному гомеостазі за умов початку розвитку патологічного процесу, а отже не може бути використаний з метою ранньої діагностики захворювань. Відомий спосіб випробування Т-лімфоцитів людини [3], який передбачає оцінку часу інкубації клітин з антигенами для оптимізації виявлення певного значення рухливості Т-клітин. Недоліком відомого способу є те, що використання часу інкубації є методичним прийомом (наближення умов експерименту до умов in vivo) для досягнення мети і дозволяє зробити висновок лише щодо окремої здатності (відповідь на дію антигену) окремого виду клітин (Т-лімфоцити). Відомий спосіб визначення функціональної активності лейкоцитів периферичної крові людини за ступенем гасіння біолюмінесценції [4] являє собою удосконалений методичний підхід до визначення фагоцитарної активності лейкоцитів з використанням культури люмінесцентних бактерій. Недоліком відомого способу є неможливість його використання з метою виявлення функціональних змін у клітинах різних типів тканин на ранніх стадіях розвитку патологічного процесу. Найбільш близьким за технічною сутністю є спосіб комплексного аналізу параметрів живих клітин, описаний Сухенко Е. П., Бакировым Т. С, Соловьевым А. А., Генераловым В. М., Васильевым Ю. В., Паком А. В. [5], який передбачає оцінку за допомогою приладу біоелектричних показників за характеристиками руху клітин, вміщених у інкубаційне середовище і знакоперемінне електричне поле, частоту якого змінюють. Недоліком найбільш близького за технічною сутністю способу є неможливість отримання чіткого уявлення про стан окремих функціональних систем в клітині та можливий напрямок їх змін, а отже - неможливість застосування способу для ранньої діагностики захворювань. Технічною задачею запропонованого способу є створення способу оцінки функціонального стану клітин біологічних об'єктів на основі можливості виявлення порушення здатності клітин до підтримання гомеостазу на ранніх стадіях розвитку патологічного процесу. Технічна задача вирішується з урахуванням наступних положень: 1. Відхилення будь-якого параметру стану клітини (наприклад, температури) від фізіологічної норми може бути класифіковане як енергетично нестійкий стан. 2. Стереотипічною реакцією клітини на такий енергетично нестійкий стан виступають процеси, які охоплюють ядерний апарат і компоненти цитоплазми, що супроводжується змінами інтенсивності синтетичних процесів з метою утримання основних клітинних функцій у межах фізіологічних норм. 3. Відхилення будь-якого параметру стану клітини (наприклад, температури) у бік збільшення 92412 4 або зменшення буде приводити до відхилення параметрів клітинних функцій від їх нормального значення, при чому великі відхилення будуть характерні для клітин з порушеним "нестійким" метаболізмом або станом [6]. Спосіб дозволяє визначити як загальний (мінімум декілька складових) функціональний стан живої клітини будь-якого типу тканини чи органу, так і окремі його характеристики (мінімум одна складова), виявити відмінності у функціональному стані клітин, які перебувають у фізіологічних умовах та клітин, за наявності умов початку розвитку патологічного процесу будь-якого характеру. Спосіб дозволяє отримати інформацію щодо здатності клітини в умовах впливу різноманітних ендогенних та екзогенних факторів підтримувати гомеостаз і оцінити резервні можливості клітини стосовно підтримання гомеостазу. Зазначений спосіб реалізується у чотири етапи: 1. Вибір об'єкту дослідження (вид клітин). 2. Вибір значущих параметрів, які характеризують загальний функціональний стан досліджуваних клітин, або окремі його складові. 3. Вибір методики вивчення обраних параметрів функціонального стану клітин. 4. Введення у послідовність методичних дій енергетичного фактору (наприклад, зміни температури інкубації) для здійснення за його допомогою енергетичного впливу на клітину з метою з'ясування можливостей або особливостей її функціонального стану за характером відповіді на цей вплив. Використовуючи метод порівняння характерів відповідей клітин, які перебувають у нормальних фізіологічних умовах, та в умовах розвитку патологічного процесу, роблять висновок щодо функціонального стану клітин у зв'язку з розвитком будьякої конкретної патології. Здійснення способу, пояснюється прикладами дослідження показників фагоцитарної здатності нейтрофілів крові людини, які відображають різні складові функціонального стану клітини: фагоцитарного показника (ФП), фагоцитарного індексу (ФI), загальної фагоцитарної активності (ЗФА). Приклад 1. - об'єкт дослідження - нейтрофіли крові людей: контрольна група - донори (група 1), досліджувана група - учасники ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС без гематологічних відхилень (група 2); - значущий параметр - фагоцитарний показник (ФП, %); - методика визначення ФП - розрахунок на основі даних аналізу фагоцитарної функції нейтрофілів методом визначення їх здатності поглинати частинки латексу [7]; - визначення ФП у групі 1 та групі 2 зазначеним методом при сталій температурі інкубації (Т С=37 С, час 60хв.) приводить до неповної оцінки реактивної здатності клітин (близькі значення ФП у групі 1 та групі 2); - використання методу "розгойдування" тепловою енергією, тобто зниження (до 30 С) або підвищення (до 40 С) температури інкубації відносно нормального фізіологічного значення (37 С) до 5 зволяє виявити суттєві відмінності значень ФП у групі 1 та групі 2, а саме більш високі значення ФП при температурі 40 С у осіб групи 2 та характер змін ФП при зменшенні та збільшенні температури інкубації, який відрізняється різноспрямованістю температурних залежностей: збільшення ФП в групі 1 поряд зі зменшенням показника в групі 2 при охолодженні (до 30 С) та зменшення ФП в групі 1 поряд із збільшенням показника в групі 2 при нагріванні (до 40 С). Залежність значень ФП від температури ілюструє Фіг. (А). Приклад 2. - об'єкт дослідження - нейтрофіли крові людей: контрольна група - донори (група 1), досліджувана група - учасники ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС без гематологічних відхилень (група 2); - значущий параметр - фагоцитарний індекс (ФІ, ум. од); - методика визначення ФІ - розрахунок на основі даних аналізу фагоцитарної функції нейтрофілів методом визначення їх здатності поглинати частинки латексу (7); - використання енергетичного впливу (зменшення та збільшення температури інкубації відносно фізіологічного значення 37 С) дозволяє виявити різноспрямованість температурних залежностей показника ФТ, яка є схожою з такою для ФП, при чому значення ФІ при сталій температурі (37 С) також є дуже близькими у обох групах і не дозволяють у повній мірі оцінити реактивну здатність клітин, що досліджуються. Залежність значень ФП від температури ілюструє Фіг. (Б). Приклад 3. - об'єкт дослідження - нейтрофіли крові людей: контрольна група - донори (група 1), досліджувана група - учасники ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС без гематологічних відхилень (група 2); - значущий параметр - загальна фагоцитарна активність (ЗФА, ум. од); - методика визначення ЗФА - розрахунок на основі даних аналізу фагоцитарної функції нейтрофілів методом визначення їх здатності поглинати частинки латексу [7]; - аналіз залежностей показника ЗФА від температури при використанні методу "розгойдування" тепловою енергією (зниження до 30 С та підвищення до 40 С температури інкубації відносно нормального фізіологічного значення – 37 С) дозволяє зробити висновки, аналогічні отриманим при дослідженні показників ФП та ФІ. Залежність значень ЗФА від температури ілюструє Фіг. (В). Таким чином, спосіб, який заявляється, є достатньо простим у застосуванні і демонструє значні можливості по виявленню функціональних змін в 92412 6 клітинах на ранньому етапі розвитку патологічного процесу будь-якого характеру, коли головною діагностичною проблемою є відсутність такої вираженої реакції клітини, яка могла б бути виявлена відомими способами. Спосіб дозволяє оцінити функціональний стан клітин будь-якого типу тканин живого організму з визначенням їх резервної можливості щодо підтримання гомеостазу. Джерела інформації: 1. Пат. 1103UA, МПК7 А61В10/00 Спосіб диференційованої оцінки ступеня ушкодження гепатоцитів при хронічному отруєнні алкоголем / Т. П. Якимова, Г. О. Ковальов: заявник і патентотримач Харківська медична академія післядипломної освіти. - № и200503691; заявл. 18.04.2005; опубл. 15.12.2005, бюл. № 12. 2. Пат. 2293332RU, МПК G01N33/68 (2006.01). Способ определения динамики скрытой активности изоферментов ЛДГ гомогената лейкоцитов: /М. В. Кусков, В. Я. Семке, С. А. Иванова, С. С. Теровский, О. Ю. Федоренко, Е. М. Епанчинцева: заявитель и патентообладатель ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН. - № 2005115615/15; заявл. 23.05.2005; опубл. 10.02.2007, бюл. № 4. 3. Заявка WO2007099341, МПК G01N33/50 (2006.01). Т cell assays / Baker М. (GB), Carr F. (GB), Rust A. (GB), Davies L. (GB). - № WO2007GB00736; заявл. 2007.03.02; опубл. 2007.09.07. 4. Заявка 2005118125RU, МПК G01N33/52 (2006.01). Способ определения фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции / С. В. Ширшев, Е. М. Куклина, С. А. Заморина и др.: заявитель и патентообладатель Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. - № 2005118125/15; заявл. 10.06.2006; опубл. 20.12.2006, бюл. № 35. 5. Заявка 2006100448RU, МПК G01N33/487 (2006.01). Способ комплексного анализа параметров живых клеток, устройство для его осуществления и его вариант / Е. П. Сухенко, Т. С. Бакиров, А. А. Соловьев, и др.: заявитель и патентообладатель НТУ "Инженерно-технический центр" ОАО "Ижевский мотозавод". - № 2006100448/15; заявл. 10.01.2006; опубл. 20.07.2007, бюл. № 20. 6. Погонцева І. М. Функціональний стан гранулоцитарної ланки гемопоезу в учасників ліквідації наслідків аварії на Чорнобильській АЕС: дис. ... канд. мед. наук: 14.03.08 / Погонцева Ірина Михайлівна. - К., 2002. - 166 с. 7. Изучение поглотительной способности нейтрофилов крови с использованием инертных частиц латекса / Потапова С. Г., Хрустиков B. C., Демидова Н. В. и др. // Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - №9. - С. 58-59. 7 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 92412 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601