Спосіб кількісного визначення яєць гельмінтів

Спосіб кількісного визначення яєць гельмінтів, що включає розведення фекалій у воді, фільтрацію, седиментацію і флотацію, який відрізняється тим, що фекалії триразово відстоюють, два рази центрифугують при 1000 об/хв., а як флотаційну рідину використовують суміш сірчанокислого цинку і цукру та визначають кількість яєць гельмінтів. Корисна модель відноситься до ветеринарної паразитології, а саме до способів кількісного визначення яєць гельмінтів в фекаліях тварин з метою визначення ступеня ураженості їх гельмінтами. Спосіб використовується для виділення і підрахунку яєць гельмінтів класу Trematoda підрядів Fasciolata та Paramphistomata в 1 грамі фекалій. Цикл розвитку паразитів проходить за участю проміжного (прісноводні молюски) та дефінітивного (переважно жуйні) хазяїв. Після міграції трематод в організмі дефінітивного хазяїна та досягнення ними статевої зрілості вони виділяють яйця у травний тракт, які з фекаліями потрапляють в зовнішнє середовище. Існують способи гельмінтоовоскопії, за допомогою яких визначають яйця збудників трематод. Засновані вони на принципах седиментації і флотації, а також їх комбінації. Більшість з них - якісні. Так, широко застосовується стандартизований спосіб послідовних зливів [Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды: Справочник. - М.: Колос, 1983.- С.53-54; Лабораторные исследования в ветеринарии: Вирусные, риккетсиозные и паразитарные болезни: Справочник / Под ред. Б.И.Антонова.- М.: Агропромиздат, 1987.- С.160] оснований на осадженні яєць гельмінтів у воді. Пробу фекалій кладуть в склянку, додають невелику кількість води, ретельно перемішують, фільтрують і доливають воду. Відстоюють, зливають до осаду, доливають воду. І так 3-4 рази до тих пір, доки надосадова рідина не буде прозорою. Осад, в якому знаходяться яйця гельмінтів, мікроскопують. Даний спосіб не є точним, особливо при низькому ступені інтенсивності трематодозних інвазій. Неможливо з його допомогою визначити і кількість яєць в 1 грамі фекалій. Є комбінований седиментаційно-флотаційний метод [Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды: Справочник.- М.: Колос, 1983.- С.60]. Пробу фекалій ретельно перемішують з водою, фільтрують в центрифужну пробірку, центрифугують, верхній шар рідини зливають, до осаду додають флотаційну рідину (суміш рівних об'ємів насиченого розчину натрію хлориду та гліцерину), центрифугують. Петлею знімають поверхневу плівку і мікроскопують. Даний спосіб не дає можливості виявити яйця трематод тому, що їх питома вага вища за щільність флотаційної рідини і вони не спливають у цій суміші. Є модифікація вищевказаного методу для дослідження жуйних на фасціольоз, стронгілятози травного тракту, трихоцефальоз та цестодози [Лабораторные исследования в ветеринарии: Вирусные, риккетсиозные и паразитарные болез (21)и200502006 (22) 04.03.2005 (24)15.09.2005 со ю со см О) 9265 ни: Справочник / Под ред. Б.И.Антонова.М.:Агропромиздат, 1987.- С.160; О копрологической диагностике фасциолеза М.Бабянскас, А.Вишняускас, А.Баракаускас, З.Свабонас // Ветеринария. - 1967. -№6. -С.58-59]. Пробу фекалій розводять у воді, фільтрують в мензурку (100 мл), проводять седиментацію шляхом дворазового відстоювання. Верхній шар рідини зливають, осад переносять в центрифужну пробірку. Центрифугують 1хв. при 1500об/хв, верхній шар зливають, до осаду додають розчин сульфату цинку (р =1,200г/см ) до утворення меніску вище країв пробірки і накривають покривним склом. Центрифугують 0,5хв. при 1500об/хв, переносять покривне скло на предметне і досліджують під мікро-скопом. Це рішення може бути найближчим аналогом. Недоліками його є значна деформація яєць, недостатня їх флотація та засмічуваність покривного скла. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб кількісного визначення яєць гельмінтів, який містить розведення фекалій у воді, фільтрацію, седиментацію, шляхом триразового відстоювання, дворазового центрифугування при 1000об/хв, використання як флотаційної рідини суміші сірчанокислого цинку та цукру, підрахунок кількості яєць гельмінтів, щоб забезпечити спосіб кількісного визначення яєць гельмінтів. Вказана задача вирішується технічним рішенням, що являє собою новий спосіб виділення яєць гельмінтів. Новим у порівнянні з найближчим аналогом є спосіб виділення яєць, в якому використовують седиментацію при центрифугуванні, флотацію при повторному центрифугуванні з подальшою мікроскопією та підрахунком яєць гельмінтів. Спосіб виконується таким чином. Проводять відбір проб фекалій в кількості 1015 грамів від однієї тварини, безпосередньо з прямої кишки, або свіжовиділені з чистої підлоги. Кладуть в окремі пакети чи мішечки з цупкого паперу. Із загальної перемішаної проби за допомогою шприца-дозатора беруть 3 грами фекалій і переносять в склянку (200мл), заливають невеликою кількістю водопровідної води (10-20мл) та ретельно перемішують шпателем. Фільтрують через металеве ситечко в іншу склянку. Загальний об'єм доводять до 200мл. Відстоюють, перший раз 15хв., другий - 10, третій - 5, зливаючи кожний раз надосадову рідину і додаючи нові порції чистої води. Зливають, осад переносять в склянку на ЮОмл, додають воду. Відстоюють 5хв., надосадову рідину зливають, осад переносять в центрифужну пробірку, додають воду. Центрифугують 1хв. при 1000об/хв, надосадову рідину зливають, додають спочатку невелику кількість флотаційної рідини (300г сірчанокислого цинку та 250г цукру на 1 літр води (р =1,200г/см3)), перемішують (ресуспензація), а потім доливають до утворення меніску рідини вище країв центрифужної пробірки. Накривають її покривним склом, центрифугують 0,5хв. при 1000 об/хв. Яйця спливають і прилипають до поверхні покривного скла. Його знімають, кладуть на сітку для підрахунку яєць та личинок гельмінтів. Визначення та підрахунок яєць гельмінтів проводять за допомогою мікроскопу з препаратоводієм при збільшенні 10x3,2 (при необхідності використовують 10x8). Проводять підрахунок кількості виявлених яєць, отриманий результат ділять на 3. Таким чином отримуємо кількість яєць в 1 грамі фекалій. Приклад 1 Пробу фекалій відбирали від корови чорнорябої породи хворої на фасціольознопарамфістомідозну інвазію, відразу після акту дефекації. З грами фекалій ретельно перемішували з 50мл води в ступці, профільтрували через ситечко в скляну мензурку ємкістю ЮОмл. Ступку декілька раз прополіскували 50мл води. Отриманий фільтрат (ЮОмл) відстоювали 5хв. Верхній шар рідини зливали, залишаючи на дні 20мл рідини з осадом. До осаду додавали 80мл води та відстоювали 5хв. Надосадову рідину зливали, залишаючи на дні Юмл осаду, переливали його в центрифужну пробірку і центрифугували 1хв. при 1500об/хв. Верхній шар рідини зливали. До осаду додавали розчин сульфату цинку (р=1,200г/см ) до утворення меніску рідини вище країв центрифужної пробірки. Накривали її покривним склом так, щоб поверхня рідини контактувала з ним. Центрифугували 0,5хв. при 1500об/хв. Покривне скло знімали, переносили на предметне скло і досліджували під мікроскопом. Було виявлено яйця фасціол, але вони деформовані і слабо забарвлені в зв'язку з витіканням вмісту. Яєць парамфістомід не ви-явлено. Приклад 2 Для встановлення діагнозу і інтенсивності інвазування трематодами у 1 грамі фекалій тієї ж хворої корови застосували запропонований спосіб, використавши пробу фекалій відібрану для першого прикладу. Шприцем-дозатором відбирали 3 грами фекалій, переносили в склянку, заливали 20мл водопровідної води, перемішували шпателем. Фільтрували завись через металеве ситечко в іншу склянку. Доводили загальний об'єм до 200мл. Відстоювали перший раз - 15хв., другий - 10, третій - 5, кожний раз зливаючи і додаючи воду. Надосадову рідину зливали, осад переносили в склянку на ЮОмл, додавали воду. Відстоювали 5хв., надосадову рідину зливали, осад переносили в центрифужну пробірку, додавали воду. Центрифугували 1хв. при ЮООоб/хв, надосадову рідину зливали. До осаду додавали невелику кількість флотаційної рідини перемішували і доливали до утворення меніску вище країв центрифужної пробірки. Накривали покривним склом, центрифугували 0,5 хв. при 1000 об/хв. Покривне скло переносили на сітку. За допомогою мікроскопу при збільшенні 10x3,2 підраховували кількість яєць трематод. Вона склала 5 яєць фасціол і 3 - парамфістомід. Кожний з отриманих результатів ділили на 3 і отримали 1,7 та 1,0 яєць в 1 грамі фекалій, відповідно. Запропонований стандартизований спосіб кількісного визначення яєць гельмінтів, що поєднав седиментацію при центрифугуванні з флотацією при центрифугуванні із заключними мікроскопією і підрахунком яєць на сітці - є висо 5 9265 6 коефективним при виявленні і встановленні інтепені інтенсивності інвазії при незначній деформансивності трематодозних інвазій (фасціольозної ції овоскопічних елементів. За допомогою даного та парамфістомідозної) у жуйних, не потребує способу також вдається визначити яйця шлункозначних економічних витрат, та забезпечує висово-кишкових стронгілят та збудників імагінальних ку точність дослідження навіть при низькому стуцестодозів жуйних. Комп'ютерна верстка Н. Лисенко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 4 2 , 01601