Спосіб кількісного визначення нітрит-аніону в біологічній рідині

ci-i : MnK6G01N33/52 СПОСІБ КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ ШТРИТ АНІОНУ В БІОЛОГІЧНІЙ РІДИНІ Винахід стосується біології та медицини. Нині існує велика кількість хворих, що потребують тривалого, а іноді і практично пожиттєвого прийому нітропрепаратів. Однак при тривалому їх вживанні у частини пацієнтів розвивається толерантність до даних препаратів, внаслідок чого різко зменшується ефективність лікування. Оксид азоту (NO) с важливим регулятором більшості метаболічних процесів в організмі людини в нормі і при самих різних паїологіях (серцево-судинної, нервової, імунної та інших систем), тому визначення кількості N0 має важливе діагностичне значення. Як правило NO вимірюється по кількості його стабільного метаболіту - нітрит аніону (NOJ). Останнім часом доведено, що NO7 в організмі людини здатний метаболічно відновлюватися в свою активну форму - N0 (див. Реутов В.П., СорокинаЕ.Г., Охотин Е.В., Косицын Н.С. - «Циклические превращения окида азота в организме млекопитающих» М : Наука, 1997, 156 с). Існуючі, на даний час, способи кількісною визначення NO^B біологічній рідині трудомісткі, довготривалі та дорогі. За прототип способу, що заявляється, був обраний спосіб кількісного визначення нітрит аніону в біологічній рідині (див. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J. [et al] Skipper P.L., Wishnok J.S., Tannenbaum S.R., Analysis of nitrate, nitrite and [I5N] nitrate in biological fluids. Analytical Biochemistry, 1982, 126, N1, p. 131138), що полягає в розведенні зразків досліджуваних біологічних рідин (наприклад, слина в 20 разів, сеча в 20 разів, шлунковий сік в 3 рази і т.д.) до певної концентрації NO2, додаванні до 0,5 мл розведеної біологічної рідини 0, І м л 35 % сульфасаліцилової кислоти, з наступним перемішуванням суміші протягом ЗО хв при кімнатній температурі до повного осадження білків, після чого суміш центрифугують 15 хв при 3500 об/хв. Надосадову рідину відділяють і додають до неї розчин луга (NaOH) до нейтрального рН. Отриману рідину пропускають через кадмієві колонки. Після цього рідину змішують з реактивом Гріса у співвідношенні ) І і нагрівають ЗО хв при 60 °С з наступним охолодженням в льодяній бані при 0 °С протягом 20 хв. Охолоджену рідину наливають в кювету і поміщають в спектрофдметр для визначення величини оптичної густини рідини при довжині хвилі 546 нм. Паралельно визначають оптичну густину стандартного розчину нітриту натрію (NaNO^). Після цього будують калібровочну криву і визначають на її основі кількість NO2 в досліджуваній рідині. Однак даний спосіб не може бути застосований широко, тому що він тривалий, трудомісткий та потребує використання дорогих реактивів. В основу винаходу була поставлена задача вдосконалення способу кількісного визначення нітрит аніону в біологічній рідині, в якому визначають кількість NO2 в нерозвсденій біологічній рідині, яку зразу після додавання сульфосаліцилової кислоти витримують в холодильнику 15-30 хв, потім центрифугують, додають розчин Гріса і зразу після цього проводять визначення оптичної густини розчину і розраховують кількість N(>f в ньому, що дозволяє скоротити час визначення NO2T зменшити трудомісткість способу та значно знизити витрати на його проведення. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі кількісного визначення нітрит аніону в біологічній рідині, який полягає у додаванні до біологічної рідини сульфосаліцилової кислоти, центрифугуванні, відділенні надосадової рідини, додаванні до неї розчину Гріса, визначенні оптичної густини рідини та обчисленні результату, згідно винаходу сульфосаліцилову кислоту додають до нерозведеної біологічної рідини, після чого витримують її в холодильнику 1530 хв. Запропонований спосіб здійснюється таким чином. У пацієнта беруть біологічну рідину (наприклад, слину) у кількості 0,5 мл в пробірку і додають до неї 0,1 мл 35 % сульфосаліцилової кислоти. Суміш витримують 20 хв в холодильнику. Потім центрифугують 15 хв при 3500 об/хв. Відділяють надосадову рідину і додають до неї розчин Гріса у співвідношенні 1:1. Отриманий розчин поміщають в кювету, наприклад, спектрофотометру завширшки 0,5 см і визначають оптичну густину розчину при ДОВЖИНІ хвилі 546 нм проти контрольної проби, що не містить біологічної рідини (замість біологічної рідини використосується дистильована вода). Паралельно визначають оптичну густину стандартних розчинів NaNO2. Будують калібровочну криву на основі отриманих даних. Кількість NO2' визначають використовуючи калібровочму криву в діапазоні 5-50 мкМ. Таким чином, в порівнянні з прототипом, використання запропонованого способу дозволить скоротити час визначення NO2* (майже на 3 год), зменшити трудомісткість способу за рахунок скорочення багатьох довготривалих етапів та значно знизити витрати на його проведення.