Спосіб оцінки безпеки застосування фетальних клітин

Спосіб оцінки безпеки застосування фетальних клітин, що включає введення мишам досліджуваних клітин і визначення їх туморогенності, який відрізняється тим, що фетальні клітини вводять мишам інтактної лінії СВА, після чого визначають експресію протоонкогенів у клітинах лімфогемопоетичного комплексу і порівнюють з експресією протоонкогенів у мишей з генетично запрограмованим розвитком онкопатології - мишей лінії С3Н/Не Lac, і при відсутності експресії протоонкогенів, що спостерігається у мишей лінії С3Н/Не Lac, визначають безпеку застосування фетальних клітин. UA (21) a201000681 (22) 25.01.2010 (24) 25.01.2011 (46) 25.01.2011, Бюл.№ 2, 2011 р. (72) ГОЛЬЦЕВ АНАТОЛІЙ МИКОЛАЙОВИЧ, ГРИЩЕНКО ВАЛЕНТИН ІВАНОВИЧ, ЛУЦЕНКО ОЛЕНА ДМИТРІВНА, ЯМПОЛЬСЬКА КАТЕРИНА ЄВГЕНІВНА, БОНДАРОВИЧ МИКОЛА ОЛЕКСАНДРОВИЧ (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) Hook LM, Agafonova Y, Ross SR, Turner SJ, Golovkina TV. Genetics of mouse mammary tumor virus-induced mammary tumors: linkage of tumor induction to the gag gene. J Virol. 2000 Oct;74(19):8876-83. Jeng-Chang Chen,ab Ming-Ling Chang,cd Hanmin Lee,a and Marcus O. Muench .Prevention of Graft Rejection by Donor Type II CD8+ T Cells (Tc2 Cells) C2 2 (19) 1 3 ладці імплантують мишам лінії AKR/JY. На основі оцінки кровотворної системи (периферичної крові, кісткового мозку, тимуса, селезінки) визначають кількість тварин з розвиненими лімфомами [3]. Недоліком цього способу є його необ'єктивність, тому що в 33 % випадків спостерігається загибель тварин у результаті імунного конфлікту (реакції «трансплантат проти хазяїна»), або від невідомих причин (у 22 % випадків). Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб оцінки безпеки застосування хондробластів у мишей лінії SCID. Спосіб полягає в наступному. Експериментальним мишам цієї лінії вводять суспензію культивованих аутологічних хондробластів (107 клітин). Тваринам з групи позитивного контролю вводять суспензію пухлинної лінії ембріональної саркоми людини, що викликає 100 % розвиток пухлин. Далі протягом 12 тижнів визначають туморогенність уведених клітин по наявності пухлин, їх кількості, розмірам, наявності регионарних і віддалених метастазів після введення клітин [4]. Основним недоліком способу є його необ'єктивність, що обумовлена тим, що клітини вводять мишам з порушеним станом імунної системи, а саме комбінованим імунодефіцитом у вигляді генетичного дефекту окремих елементів генів імуноглобулінів і Т-клітинного рецептора, що приводить до порушення диференціювання попередників Т- і В-клітин. Хоча ці тварини мають лимфовузли і тимус, але ці органи зменшені в розмірах. Тому об'єктивна оцінка імовірності онкологічних змін в цих органах після введення клітин неможлива. В основу винаходу поставлена задача створення такого способу оцінки безпеки застосування ФК, який би завдяки використанню молекулярногенетичного критерію, забезпечив об'єктивну оцінку безпеки застосування фетальних клітин. Поставлена задача вирішується тим, що в способі оцінки безпеки застосування фетальних клітин, який включає введення мишам досліджуваних клітин і визначення їх туморогенності, відповідно до винаходу, фетальні клітини вводять мишам інтактної лінії СВА, після чого визначають експресію протоонкогенів у клітинах лімфомієлоідного комплексу і порівнюють з експресією протоонкогенів у мишей з генетично запрограмованим розвитком онкопатології - мишей лінії С3Н/Не Lac, і при відсутності експресії протоонкогенів, що спостерігається у С3Н/Не Lac мишей, визначають безпеку застосування фетальних клітин. Визначення експресії протоонкогенів забезпечує об'єктивність оцінки безпеки уведення фетальних клітин, оскільки використаний критерій відбиває на молекулярно-генетичному рівні стан імунокомпетентних клітин і дозволяє виявити механізм дії фетальних клітин, що уводяться, на елементи лімфомієлоідної системи. Здійснення способу можливе при використанні інтактних мишей СВА, що мають імунологічно нескомпроментовані органи лімфогемопоетичної системи, у той час як на мишах лінії SCID, через генетичний дефект стану імунної системи, об'єктивно оцінити імовірність онкологічних змін у цих органах неможливо. 93321 4 Спосіб здійснюють таким чином. Мишам лінії СВА уводять фетальні клітини. Групу позитивного контролю складають миші лінії С3Н/Не Lac, групу негативного контролю складають миші СВА. В усіх трьох групах тварин беруть одного віку - 12-13 місяців. Через 30 днів у тварин експериментальної групи й у мишей контрольних груп одержують кістковий мозок, селезінку, тимус, лімфовузли. З клітин цих органів виділяють нуклеїнові кислоти. Використовуючи полімеразну ланцюгову реакцію і праймери до протоонкогенів src, abl, lck і jak-1 ідентифікують їхню експресію за допомогою спеціальної апаратури (чип-аналізатор Agilent 2100), оснащеною системою детекції й оцінки кількісного змісту продуктів полімеразної ланцюгової реакції. Порівнюють туморогенність - топографію (нове місце) та підвищення експресії протоонкогенів у досліджених органах експериментальної групи і групи позитивного контролю. При відсутності експресії протоонкогенів у мишей СВА, що спостерігається у С3Н/Не Lac мишей, визначають безпеку застосування фетальних клітин. Протоонкогени src, abl, lck і jak-1 мають безпосереднє відношення до керування станом проліферації, диференціювання та інших характеристик імунокомпетентних клітин [5, 6]. Вони кодують синтез кіназ, продукція яких у фізіологічних умовах активується факторами росту, цитокінами, гормонами і т.д. У той же час, ці кінази можуть бути причетні до пухлинної трансформації лімфоідних і нелімфоідних клітин при різних ситуаціях [7, 8, 9]. Хоча jak1-ген не відноситься до класичних протоонкогенів, однак і він часто залучає в пухлинну трансформацію В- і Т-лімфоцити через активуємі ним STAT3 і ERK-сигнали [10]. Тобто цілком закономірно, що така маніфестація відбувається в період початку клінічного розвитку генетично детермінованої патології у вигляді раку молочної залози у тварин лінії С3Н/Не Lac [11]. Приклад Для оцінки безпеки уведення ФК мишам лінії СВА уводили внутрішньовенно 5106 клітин фетальної печінки (КФП). Через 30 днів після введення КФП тварин забивали дислокацією шийних хребців. Клітини кісткового мозку вимивали зі стегнової кістки забуференим фізіологічним розчином. Суспензію клітин одержували шляхом багаторазового пропущення через голки зменшуваного діаметра. Клітини тимуса, селезінки, лімфовузлів, що містять ядра, одержували шляхом гомогенізації в гомогенізаторі Потера в 2 мл забуференого фізіологічного розчину, фільтрували через нейлоновий фільтр. Кількість клітин у суспензіях враховували в камері Горяєва в світловому мікроскопі «ЛОМО» при збільшенні в 1540 разів. Для виділення нуклеїнових кислот в експериментах використовували 1106 клітин з кожної суспензії. Для виділення нуклеїнових кислот використовували метод фенольної екстракції [13]. Реакцію зворотної транскрипції ставили з використанням специфічних олігонуклеотидів і ревертази (ММlv)(ЦНІІЕ МЗ РФ). Праймери для полімеразної ланцюгової реакції були підібрані на основі бази даних, опубліко 5 93321 ваних на сайті «GenBank» (NCBI, USA) : abl -АК 037887.1 src - АК 146056.1 lck - АК 088001.1, jak1 АК 134143.1, синтезованими в АТЗТ «Медбіосервіс» м. Києва. Ампліфікацію фрагментів ДНК проводили в термостаті «Терцик» ЗАТ «НВФ ДНКтехнологія» (Росія). Кількісну детекцію продуктів ампліфікації проводили методом капілярного електрофорезу в чип-аналізаторі «Agilent 2100» (США). Представлені в таблиці дані свідчать про те, що транскрипти кожного з обраних протоонкогенів конститутивно експресувались у різному ступені в якомусь або якихось з досліджуваних органів інтактних мишей СВА. Наприклад, транскрипти гена jak1 були виявлені у всіх досліджених органах лімфогемопоетичного комплексу. Мінімальна експресія була виявлена в кістковому мозку і тимусі, максимальна - у селезінці і лімфовузлах. Даний факт підтверджує важливість і значення кодуємої геном jak1 тирозинової кінази Januse kinase у реалізації каскадних сигнальних шляхів у тканинах лімфогемопоетичного комплексу ссавців у фізіологічних умовах. Тільки в селезінці і тимусі цих же 6 мишей визначалася експресія транскриптів протоонкогена abl. У меншому ступені експресирувались протоонкогени src і lck у кістковому мозку і лімфовузлах. З представлених у таблиці даних також видно, що в мишей С3Н/Не Lac картина експресії протоонкогенів зовсім інша. Так, src і lck-гени, транскрипти яких не визначалися в селезінці і тимусі мишей СВА, експресирувались у цих органах у мишей С3Н/Не Lac. Експресія гена jak у мишей С3Н/Не Lac топографічно повторювала таку в кістковому мозку і тимусі інтактних тварин. Однак, якщо в тимусі ступінь її була ідентичною, то в кістковому мозку мишей С3Н/Не Lac перевищувала майже в 25 разів. Нова топографія експресії в мишей С3Н/Не Lac була встановлена і для протоонкогена abl. Транскрипти цього гена експресирувались у лімфовузлах мишей С3Н/Не Lac, де вони не визначалися в мишей СВА. Крім того, у клітинах тимуса було встановлене підвищення експресії цього гена в порівнянні з інтактними мишами в 5,8 рази. Таблиця Експресія протоонкогенів у клітинах лімфогемопоетичного комплексу мишей С3Н/Не Lac і СВА після введення КФП Група Тварин СВА С3Н/Не Lac СВА+КФП Кількість фрагмен- Кількість фрагме- Кількість фрагментів Кількість фрагментів src (нг) нтів lсk (нг) jak1 (нг) тів abl (нг) Селезінка 29,0±13,12 5,0±2,21 Лімфовузли 3,05±1,16 30,0±13,18 Кістковий 20,37±10,22 13,33±5,72 мозок Тимус 1,95±0,56 10,2±5,43 Селезінка 1,54±0,83 Лімфовузли 110,18±43,21 Кістковий 340,55±110,40* мозок Тимус 1,8±0,94 1,31±0,28 58,4±22,04* Селезінка 13,32±5,41 39,1±16,11 Лімфовузли 22,90±9,91 5,95±1,91 Кістковий 20,0±8,44# 88,0±31,55 мозок Тимус 0,99±0,41 Орган Примітка - наявність експресії протоонкогена в клітинах різних органів, * - відмінності достовірні при порівнянні показника у мишей С3Н/Не Lac і СВА, # - відмінності достовірні при порівнянні показника у мишей С3Н/Не Lac і СВА+КФП, р < 0,05 Для всіх обраних протоонкогенів характерне нове місце експресії (топографія) у лімфогемопоетичному комплексі мишей С3Н/Не Lac у порівнянні з інтактними здоровими мишами СВА. Іншими словами, нову топографію експресії можна сприймати як факт оверекспресії цих генів (включаючи і jak у кістковому мозку) у мишей С3Н/Не Lac. Таким чином, нові топографічні точки або оверекспресія протоонкогенів у порівнянні з мишами СВА служать маркерами туморогенності. Тому, як позитивний контроль розвитку онкопатології були узяті миші лінії С3Н/Не Lac 13місячного віку з генетично запрограмованим розвитком раку молочної залози. У якості ідентифікуємих маркерів туморогенності були узяті транскрипти протоонкогенів c-src, lck, jak-1 і abl у клітинах кісткового мозку, селезінки, тимуса, лімфовузлів. Характер зміни експресії зазначених протоонкогенів у мишей СВА після введення КФП свідчить про те, що після введення КФП експресія src, lck, 7 93321 abl протоонкогенів не збігалася топографічно в жодному з органів лімфомієлоідного комплексу з такою у мишей С3Н/Не Lac. Хоча топографічна картина експресії генів jak1 після застосування КФП у кістковому мозку була аналогічною позитивному контролеві, однак рівень експресії істотно відрізнявся від рівня в мишей С3Н/Не Lac. На підставі отриманих результатів можна зробити висновок, що запропонований спосіб оцінки безпеки застосування фетальних клітин відбиває стан генетичного апарату клітин лімфогемопоетичного комплексу організму і може служити важливим об'єктивним критерієм атестації бластогенного потенціалу уведених фетальних клітин. Джерела інформації: 1. Tassone P., Tuccillo F., Bonelli P., D'Armiento F.P., Bond H. M., Palmieri C, Tagliaferri P., Venuta S. Fetal ontogeny and tumor expression of the early thymic antigen UN1 // Int. J. Oncol. -2002. - Vol. 20, № 4. - P. 707-711. 2. Aguilar S., Nye E., Chan J. Loebinger M. Murine but not human mesenchymal stem cells generate osteosarcoma-like lesions in the lung// Stem cells. - 2007. - V.25. - P. 1586-1594. 3. Итин В.И., Прибытков Г.А., Хлустов И.А. Имплант - носитель клеточного материала из пористого проницаемого титана. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2006. - № 3. С. 59-63. 4. Ржанинова А.А., Ермакова Н.П., Меркулова И.Б. Исследование безопасности трансплантации культивированных аутологичных хондробластов человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2009. - № 3. – С. 143-148. Комп’ютерна верстка В. Мацело 8 5. Фаллер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. Пер. с англ. М.: БИНОМ-Пресс, 2003. - с. 234-236. 6. Shi М., Cooper J.C., Yu C. L.A constitutively active Lck kinase promotes cell proliferation and resistance to apoptosis through signal transducer and activator of transcription 5b activation // Моl. Cancer Res. - 2006. - № 1. - P. 39-45. 7. Majolini M B; D'Elios M M; Galieni P; Boncristiano M Expression of the T-cell-specific tyrosine kinase Lck in normal B-1 cells and in chronic lymphocytic leukemia В cells. //Blood 1998. - Vol. 91, № 9. - P. 3390-3396. 8. Jallal H., Valentino M.-L., Chen G.A Src/Abl kinase inhibitor, SKI-606, blocks breast cancer invasion, growth, and maetastasis in vitro and in vivo // Cancer Research. - 2007. - Vol. 67. - P. 1580-1588. 9. Srinivasan D., Planner R. Activation of Abl tyrosine kinases promotes invasion of aggressive breast cancer cells // Cancer Research. - 2006. - Vol. 66. - P. 5648-5655. 10. Neilson L.M, Zhu J., Xie J. Coactivation of Janus Tyrosine Kinase (Jak)1 Positively Modulates Prolactin-Jak2 Signaling in Breast Cancer: Recruitment of ERK and Signal Transducer and Activator of Transcription (Stat)3 and Enhancement of Akt and Stat5a/b Pathways //Molecular Endocrinology. - 2007 - Vol. 21. - № 9. - P. 22182232. 11. Callahan R., Smith G. H. MMTV-induced mammary tumorigenesis gene discovery, progression to malignancy and cellular pathways. - Oncogene. 2000. - V. 19, N 8. - P. 992-1001. 12. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ. /под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. - М.: Мир, 1999. - С. 307-309. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601